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阳性对照和阴性对照的体外gtpγs/ gdp蛋白质上样量

注意：体内细胞---将激l活可用arf 6的大约10％，而体外gtpγs蛋白负载将激l活arf 6的将近90％。

1，将0.5 ml每种细胞提取物等分到两个微量离心管中或使用1 μg纯化的arf 6蛋白。

2，向每个试管中加入20 μl 0.5 m edta终浓度为20 mm。

3，将5 μl 100 xgtpγs至100 μm，终浓度加到一个试管中阳性对照。

4，在第二个试管中加入5 μl 100 x gdp至1 mm，终浓度阴性对照。

5，在搅拌下将试管在30°c孵育30分钟。

6，通过将试管放在冰上并添加32.5 μl 1 m mgcl2至60 mm，终浓度来停止加载。

当前没有直接测定法来测量arl1 gtpases的激l活。

neweast biosciences arl1激l活检测试剂盒基于特定于配置的单克l隆抗l体，该抗l体特---识别arl1-gtp，但不能识别arl1-gdp。 鉴于单克l隆抗l体对其抗原的高度亲和力，可以在短时间内进行激l活测定。 该测定法可提供---的结果，并具有一致的可重复性。

检测步骤

ι。活性cdc42 pull-down实验

1. 等分0.5-1 ml的细胞裂解物至微量离心管中。

2. 向管中加入1ml的1x assay/lysis 缓冲液。

3. 向管中加入1ul的活性cdc42单克l隆抗l体。

4. 用涡旋振荡仪将protein a/g凝胶柱充分混匀，然后快速的吸出20ul悬浮珠浆液加入离心管中。

5. 将管置于4°c条件下孵育1h，并轻轻的进行摇动。

6. 5000g，离心1分钟。

7. 弃上清，这一步要非常小心以避免珠子的损失。

8. 用0.5 ml的1x assay/lysis缓冲液洗涤珠子三次，离心并弃去上清。

9. 后一次洗涤后，小心的移去所有的上清。

10. 用20ul的2x sds-page样品缓冲液重悬样品。

11. 样品煮沸5min。

12. 5000g，离心10s。