双抗体夹心法的操作步骤

双抗体夹心法是检测抗原常用的方法，操作步骤如下：

一、将特抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。

二 、加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。

三、加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。

四、加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合，此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。

根据同样原理，将大分子抗体分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。

此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如hbsag、hbeag、afp、hcg等。只要获得针对受检抗原的---抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体好分别取自不同种属的动物，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步法检测，假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如hbsag的a决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在hbsag的检测中应注意亚型问题，hbsag有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，显然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。

用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有rf，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用fab＇或fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了fc段，从而可消除rf的干扰。双抗体夹心法elisa试剂是否受rf的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标。

双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。反应模式与双抗体夹心法类似。用特---抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。标志物中抗hbs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。

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