9.如何计算引物的tm值？
答：引物设计软件都可以给出tm，与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲的离子强度有关。
长度为25mer以下的引物，tm计算公式为：
tm = 4℃ (g + c)+ 2℃ (a + t)
对于更长的寡聚核苷酸，tm计算公式为：
tm = 81.5 + 16.6 x log10[na+] + 0.41 (%gc) - 600/size
公式中，size = 引物长度。
tm的定义：tm = temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. in the absence of destabilizing agents， like formamide/urea， tm will depend on 3 major parameters: the sequence: a gc-rich sequence has a higher melting temperature. the strand concentration: high oligonucleotide concentrati favor hybrid formation，-， which results in a higher melting temperature. the salt concentration: high ionic strength results in a higher tm as cati stabilize the dna duplexes.
分子与质粒载体构建
实验原理
外源dna与载体分子的连接就是dna重组，渭南pcr，这样重新组合的dna叫做重组体或重组子。重组的dna分子是在dna连接酶的作用下，有mg2+、atp存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源dna分子进行连接。dna连接酶有两种：t4噬菌体dna连接酶和大肠dna连接酶。两种dna连接酶都有将两个带有相同粘性末端的dna分子连在一起的功能，而且t4噬菌体dna连接酶还有—种大肠连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链dna分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高t4噬菌体dna连接酶浓度或增加dna浓度来提高平末端的连接效率。
t4噬菌体dna连接酶催化dna连接反应分为3步：，t4dna连接酶与辅助因子atp形成酶—amp复合物；然后，酶—amp复合物再结合到具有5磷酸基和3-切口的dna上，使dna腺苷化；后产生一个新的磷酸二酯键，-多少钱，把切口封起来。
dna重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过(牛碱性磷酸酶)cip处理克服。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性.但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中温度，即12-16℃，连接12-16h(过夜)，这样既可大限度地发挥连接酶的活性，又-到短暂配对结构的稳定。
18.引物是经过page纯化的，为什么还有碱基缺失或插入？
答：理论-析型page变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备page电泳，上样量都是非常大，电泳时的条带非常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带回收目的引物时，很难说不割到差别仅几个碱基的引物。国内有一个不好的现象，page纯化的引物，-是长引物要的量都比较高，pcr实验室，导致割的条带有时可能比较宽。建议：您如果减少od数，引物遇到的问题可能就会少一些。
19. taqman 探针设计的基本原则是什么？
答：下列原则供您参考。
◆taqman 探针位置尽可能靠近扩增引物扩增产物50-150bp，但不能与引物重叠。
◆长度一般为18-40mer 。
◆g-c含量控制在40-80%左右。
◆避免连续相同碱基的出现，-是要避免gggg或更多g出现。
◆在引物的5端避免使用g。
◆选用比较多的碱基c。
◆退火温度tm控制在 68-70c 左右。
有用的荧光染料参数
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