甲l基化特---的pcr
herman 等 1996 在使用重---酸盐处理的基础上新建的一种方法。该方法敏感性高，主要用于作定性研究。用------盐处理基因组dna，所有未发生jia基化的胞嘧定被转化为尿嘧ding，而jia基化的胞嘧定不变；随后设计针对jia基化和非jia基化序列的引物进行pcr。通过电泳检测msp扩增产物，如果用针对处理后jia基化dna链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在jia基化；反之，说明被检测的位点不存在jia基化。
特点：适用范围广，能够检测特异位点是否发生jia基化。
------盐测序法bisulfite sequencing pcr，bsp
------盐修饰后测序法 bsp frommer 等 1992 提出的研究 dna jia基化方法，此方法---性及jing确度高，能明确目的片段中每一个 cpg 位点的jia基化状态。用------盐处理基因组dna，所有未发生jia基化的胞嘧ding被转化为尿嘧ding，而jia基化的胞嘧ding不变。随后设计bsp引物进行pcr，实时定量pcr，在扩增过程中尿嘧定全部转化为胸腺嘧定，zui后对pcr产物进行测序就可以判断cpg位点是否发生jia基化，称为bsp-直接测序法。将pcr产物克long至载体后进行测序，可以提高测序成功率，安康pcr，这种方法称为bsp-ke隆测序法。
特点：jing确度高，能够准确检测出jia基化的程度百分比。
聚合酶链式反应(pcr)
操作步骤
1.在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
1qpcr buffer
5 μl
dntp mix( 2mm )
4 μl
引物1(10pm)
μl 2
引物2 ( 10pm)
2μl
taq酶(2u/ul)
1 μl
dna模板( 50ng-1μg/μl )
1 μl
加ddh2o至
μl 50
视pcr仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，pcr检测，立即置pcr仪上执行扩增。-般:在93°c
预变性3-5min ，进入循环扩增阶段: 93°c 40s***58°c 30s***72°c 60s ，循环30-35
次，后在72°c保温7min。
3.结束反应， pcr产物放置于4°c待电泳检测或-20°c长期保存。
4. pcr的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油，实时荧光定量pcr，需用100ul进行抽提反应混合液，以
除去石蜡油;否则，直接取5- 10μl电泳检测。
单细胞测序英语：single cell sequencing采取优化的下一代dna测序技术ngs检测单细胞的序列，可以获得特定微环境下的细胞序列差异以方便研究其功能差异等。对个体细胞的dna测序可以帮助我们了解例如在中的小范围细胞的变异；对其进行rna测序可以帮助我们了解和鉴别不同的细胞类型与其表现的基因，对研究发育生物学等有较大裨益。
分离单细胞
在全基因组扩增和测序前，有很多方法可以分离细胞个体，其中流式细胞术facs较为常用。个体细胞可以用显微操作来收集，这样较为快捷而且成本较低，但是比较有技术难度，而且显微镜下对细胞的错误分类容易影响实验结果。激光捕获显微切割技术lcm亦可以用来收集单细胞。但是尽管激光捕获显微切割可以保留样本细胞在组织中的空间位置，但是捕获单细胞的时候容易连带周围细胞的物质。高通量的细胞个体分离还可以使用微流控技术。微流控技术和流式细胞技术都能准确而自动地分离无偏样本。但是，两种方法都要求首先将细胞从其为环境中脱离，因此可能在rna表达分析中造成对转录数据的干扰。
|
登录后台
