细胞实验介绍——慢-建立稳转细胞系
慢-包装：公司使用3质粒慢-包装系统，慢-系统使用plko.1-egfp、pspax2、pmd2.g，过表达慢-系统使用plvx-acgfp、pspax2、pmd2.g三质粒系统，将质粒混匀后使用磷酸钙转染方法转染至hek293t细胞中，培养48h后，收集上清。使用genecopo公司慢-颗粒纯化试剂盒将慢-纯化。纯化后留取部分检测-滴度，其余-冻存于-80℃冰箱中。
滴度检测：将-颗粒使用梯度稀释，分别293t细胞，72h后，细胞毒性实验，在荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况。根据细胞荧光量计算-滴度。
细胞：在-前-对细胞进行计数，接种约10000个细胞于12孔板中，培养过夜后使用无培养基稀释-，加入12孔板中对细胞进行，-数量根据细胞的moi加入若无moi，需做-梯度：1，5，10，50，100 5个梯度对细胞，6h后去除含-溶液，加入完全培养基细胞培养，培养48h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光强度。同时加入puromycin对细胞筛选，筛选约2周时间。细胞筛选好后，使用定量pcr和western blot检测目的基因的稳定表达情况。
实验流程：慢-质粒构建-hek293t细胞培养-质粒转染293t细胞--收集--纯化--滴度检测-细胞-稳转细胞筛选-稳转细胞鉴定
结果示例：
图 a -滴度检测；b 目的细胞-效果图
软琼脂培养克l隆形成试验基本步骤:
(1)取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶-并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活l细胞计数，用含20%胎牛血l清的dmem培养液调整细胞密度至1x106细胞/l。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。
(2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40日中不会凝固。
(3)按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2xdmem培养基(含有2x和20%的小牛血l清)混合后，取3ml混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7~ 10ml)，冷却凝固，可作底层琼脂置co2温箱中备用。
(4)按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2xdmem培养基在无菌试管中相混以后，商洛细胞，再向管中加入0.2ml的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37回5%co2温箱中培养10~14天。
(5)把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞数。计算形成率。软琼脂培养法常用检测肿l瘤细胞和转化细胞系。试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过40日。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，一般6cm的平皿接种1000个细胞。正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克l隆形成试验。
软琼脂集落形成率实验(软琼脂克l隆)
将1.2%低熔点琼脂糖与2x细胞培养基以1:1的体积比混合制备0.6%的底层琼脂，6孔板中每个孔1.4ml温室凝固，取对数期细胞，胰酶-后吹散成单个细胞悬液，计数，并调细胞浓度为10000个/ml，将0.6%低熔点琼脂糖与2x细胞培养基以1:1的体积比混合，制备0.3%的上层琼脂，每孔加1ml 上层琼脂和100ul单细胞悬液(约1000ell/wel)， 混匀，室温凝固。置于37目，5%co2的细胞培养箱中培养2-3周，计数含50个细胞以上得克l隆，计算细胞集落形成率，spotll 采集图像。
-检测
本公司应用mtt比色法， 检测细胞存活和生长。其检测原理为huo细胞内线粒体中的-脱氢酶能催化外源性无色的mtt形成蓝色的结晶formazan，并沉积在细胞中，而-无此功能。二jia基-dmso能溶解细胞中的formazan，用酶联mian疫检测仪在一定波长处测定其光吸收值，可间接反映huo细胞数量。在一定细胞数范围内，mtt结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、-的抗肿liu药wu筛选、细胞毒性试验、以及肿liu放she敏感性测定等。服务内容 1. 细胞接种：收到客户细胞后，我们会用细胞计数板计数细胞，得出细胞悬液浓度。计算出应稀释的倍数，按mtt试剂盒要求在96孔板内接种 相应浓度的细胞悬液；
2. 细胞培养：然后在无菌恒温细胞培养箱内培养接种好的96孔细胞培养板，并实时观察细胞状态；
3. yao物处理并呈色：按不同浓度梯度加入yao物作用细胞；
4. 溶解，比色：加入mtt检测试剂，按操作要求孵育相应时间，在mei标仪内检测对照组和实验组的吸光值。并处理数据得出比色结果。
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