小鼠精原gan细胞分离富集和培养
成年小鼠gao丸中约有108个细胞，其中约有 2×104个是精原gan细胞，仅占gao丸生精上皮细胞总数的 0.02～0.03%，精原gan细胞数量太少不利于体外培养.分离和富集精原gan细胞成为精原gan细胞体外培养能否成功的前提条件.寻找分离和富集小鼠精原gan细胞有效方法. 方法:出生6-8天小鼠为实验对象，先用0.25%胰酶1mm edta---gao丸10min，细胞迁移实验，用胎牛xue清终止---，用一次40-um孔径的滤器过虑制成单 细胞悬液，30%percoll不连续密度梯度法离心富集精原gan细胞，再根椐未分化精原gan细胞表面thy1.2(cd90.2)阳性cd117(c- kit)阴性特点用流式细胞仪将精原gan细胞分选出来，并在体外进行培养尝试. 结果:30%percoll密度梯度离心前cd117(c-kit)阳性细胞占13.80±3.34%，293t细胞，cd90.2阳性细胞占28.98±4.51%， 二者都阳性细胞占8.98±2.98%，cd117阴性cd90.2阳性细胞占18.36±2.67%;离心后 cd117(c-kit)阳性细胞占12.37±3.34%，cd90.2阳性细胞占56.98±4.51%，重庆细胞，二者都阳性细胞占 8.20±3.98%，cd117阴性cd90.2阳性细胞占32.36±3.67%;cd117(c-kit)阳性细胞和二者都阳性细胞所占百分比前后 比较差异无---性(p>;0.1)，cd90.2阳性细胞和cd117阴性和cd90.2阳性细胞所占百分比前后比较差异有---性 (p<0.05);采用cd117和cd90.2作为标志分子，percoll离心后细胞悬液经facs分选后获得细胞纯度
细胞elispot检测
1．培养板的预处理：在24孔培养板内加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，4h，弃掉板中的处理液，用pbs洗涤3次，每次3min；
2．抗原包被：将适量抗原溶于包被缓冲液中，每孔加入0.5ml，4℃过夜，pbs-t洗涤3次，每次3min；
3．制备细胞悬液：将待测已致敏小鼠处死，取出pi脏，置于加有hanks液的平皿内，用钝头直角9号zhu射器针头破少许脾被膜后，赶出细胞，用毛细吸管轻轻吹散细胞团后，将悬液通过250目尼龙网，取滤液，细胞实验外包，1000r/min离心5min，hanks液洗涤3次，计数细胞后，用1640液重新悬浮细胞，配成所需浓度；
4．往各孔中加入0.5ml含不同浓度104-106/ml的细胞悬液，置37℃，5％co2条件下孵育2-4h，弃掉培养液，pbs-t洗涤3次，每次3min；
5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗tibio-ab2μg/ml，37℃孵育1h或4℃过夜，弃掉液体，pbs-t洗涤3次，每次3min；
6．加入辣根---化物酶结合的亲合素avi-hrp2μg/ml，37℃孵育30min，弃掉液体，pbs-t洗涤3次，每次3min；
7．配制明胶-底物液：在37℃水浴中，将2.5mltmb溶液4mg/ml jia醇溶液滴加入7.5ml10%明胶溶液用ph5.0磷酸钠-柠檬酸缓冲液配制边加边搅，溶液呈白色，加入14μl 3% h202；
8．显色与计数：将培养板底冰浴，每孔加入0.6ml明胶-底物液，约3min，混合液凝固，将培养板取出，置室温5min，将板倒置，用肉眼和低倍放大镜计数所显示出的颜色的斑点。
公司目前拥有多项产品及技术，其中发明两项，软件著作权八项，实用新型三项，商标两件。公司先后获得“江苏省民营科技企业”、“江苏省科技型中小企业”、“江苏省-中小企业”等荣誉---，连续多年被评为“东南大学大学科技园企业”。2019年公司成为江苏省生物技术协会第七届理事会的特邀理事，成立了“李冬冬---工作室”，并获得了南京市“工人先锋号”的---。
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