永生化滇西亚种-肝细胞培养方法

永生化滇西亚种---肝细胞培养方法：
1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代
弃去培养上清，用pbs或生理盐水清洗1-2次；
加入2ml0.25%胰酶t25瓶，使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱---；
1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认---情况后加入完全培养基终止---；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续---至可以轻轻吹打下为止；
将细胞悬液1000rpm左右条件下离心4min，弃上清；
用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，t25培养瓶加6-8ml培养基；
悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。
2、细胞复苏：
将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。
在1000rpm左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。
3、细胞冻存：待细胞生长状态---时进行细胞冻存保种
弃去培养上清，用pbs或生理盐水清洗1-2次，加入1ml 0.25%胰蛋白酶t25瓶
1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认---情况后加入完全培养基终止---；
将细胞悬液1000rpm左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；
将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

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