重组人ARF6 蛋白

当前没有直接测定法来测量arl1 gtpases的激l活。

neweast biosciences arl1激l活检测试剂盒基于特定于配置的单克l隆抗l体，该抗l体特---识别arl1-gtp，但不能识别arl1-gdp。 鉴于单克l隆抗l体对其抗原的高度亲和力，可以在短时间内进行激l活测定。 该测定法可提供---的结果，并具有一致的可重复性。

 1.抗活性的arl1，小鼠单克l隆抗l体货号26924：一小瓶–溶于ph 7.4的pbs中的22 μl1mg / ml，含有50％甘油和0.05％---l化钠。该抗l体特---识别所有脊椎动物的arl1-gtp。

2.蛋白a / g琼脂糖目录号30301：一小瓶– 400 μl 50％浆液。

3. 5x测定/裂解缓冲液目录号30302：一瓶– 30 ml的250 mm tris-hcl，ph 8，750mm nacl，50 mm mgcl2，5 mm edta，5％triton x-100。

4.抗arl1，小鼠单克l隆抗l体目录号26056：一小瓶– 100 μl1 mg / ml

ph 7.4的pbs中含有50％的甘油。

5. 100 xgtpγs货号30303：1瓶– 100 μl，10 mm，使用5 μlgtpγsgtp标记的0.5 ml细胞裂解物。

6. 100 x gdp产品目录号30304：一个样品瓶– 100 μl，100 mm，使用5 μl gdp

gdp标记的0.5 ml细胞裂解物。

1.---的和非---的细胞裂解液

2.蛋白酶抑制l剂

3. 4°c管摇杆或摇床

4. 0.5 m edta，ph8.0

5. 1 m氯---

6. 2倍还原sds-page样品缓冲液

7.电泳和免l疫印迹系统

8.免l疫印迹洗涤缓冲液，例如tbst10 mm tris-hcl，ph 7.4，0.15 m nacl，0.05％tween-20

9.免l疫印迹封闭缓冲液tbst包含5％脱脂奶粉或3％bsa

10. pvdf或硝l酸纤维素膜

11.二抗

12. ecl检测试剂

?1x测定/裂解缓冲液：短暂混合5x储备液，并在去离子水中稀释至1x。 在使用前，添加蛋白酶抑制l剂，例如1 mm pmsf，10 μg / ml亮肽素和10 μg / ml抑肽酶。

试剂制备

1x assay/lysis buffer：实验前用去离子水将5x的assay/lysis缓冲液稀释成1x的缓冲液，并在使用前加入蛋白酶抑制l剂如1 mm pmsf, 10 μg/ml leupeptin亮肽素，或 10 μg/ml aprotinin抑肽酶。

样品处理

贴壁细胞

1. 培养细胞密度达到大约80%-90%之间直径10 cm培养皿，~107个细胞，并用活性剂或抑制l剂进行处理。

2. 吸去培养基并用冰冷的pbs洗涤两次。

3. 向细胞中加入1x assay/lysis缓冲液每个直径10cm的组织培养皿中加入0.5-1ml。

4. 将培养皿放置于冰上处理10-20分钟。

5. 用细胞刮棒把细胞从培养皿下分离下来。

6. 将细胞裂解物转入合适的管中并放置于冰上。

7. 如果核发生裂解，细胞裂解物可能会变得非常的粘稠并且难以吸取。当这种情况出现时，将细胞裂解物用27?的注射l器针头来回吸取3-4次，以破坏基因组dna，从而避免上述情况的出现。

8. 4°c 12000 g, 离心10 min。

9. 收集上清~1-2 mg总蛋白并放置于冰上使用。如果样品不立即使用，请将处理后的样品存放于-70°c条件下。