IP-WB活性检测试剂盒-“本信息长期有效”

这些抗arf 6-gtp单克l隆抗l体还可用于通过免l疫组织化学监测细胞和组织中arf 6的激l活。

neweast biosciences arf6激l活测定试剂盒提供了一种简单且快速的方法来监测arf 6的激l活。每个试剂盒均提供足够的量以执行20个测定。

neweast biosciences arf 6激l活检测试剂盒基于特定于配置的抗arf 6-gtp单克l隆抗l体，可从细胞提取物或体外载有gtpγs的arf 6激l活检测方法来测量活性arf 6-gtp水平。 简而言之，抗活性的arf 6小鼠单克l隆抗l体将与含有arf 6-gtp的细胞裂解液一起孵育。 然后，结合的活性arf 6将被蛋白a / g琼脂糖拉低。 分别使用抗arf 6兔多克l隆抗l体通过免l疫印迹分析检测沉淀的活性arf 6。

阳性对照和阴性对照的体外gtpγs/ gdp蛋白质上样量

注意：体内细胞---将激l活可用arf 6的大约10％，而体外gtpγs蛋白负载将激l活arf 6的将近90％。

1，将0.5 ml每种细胞提取物等分到两个微量离心管中或使用1 μg纯化的arf 6蛋白。

2，向每个试管中加入20 μl 0.5 m edta终浓度为20 mm。

3，将5 μl 100 xgtpγs至100 μm，终浓度加到一个试管中阳性对照。

4，在第二个试管中加入5 μl 100 x gdp至1 mm，终浓度阴性对照。

5，在搅拌下将试管在30°c孵育30分钟。

6，通过将试管放在冰上并添加32.5 μl 1 m mgcl2至60 mm，终浓度来停止加载。

免l疫印迹和检测所有步骤均在室温下搅拌

1.在电印迹步骤之后，将pvdf膜浸入100％甲l醇中15秒钟，然后使其在室温下干燥5分钟。注意：如果使用硝l酸纤维素代替pvdf，则应跳过此步骤。

2.在室温下不断搅拌下，在tbst中用5％脱脂奶粉或3％bsa封闭膜1小时。

将膜与抗arf 6兔多克l隆抗l体在5％脱脂奶粉或3％bsa / tbst中以1：50?1000取决于样品中arf 6蛋白质的量新鲜稀释，孵育1-在室温下持续搅拌2小时或过夜4oc。

3.用tbst将印迹的膜清洗3次，每次5分钟。

4.将膜与二抗例如山羊抗兔igg，hrp偶联物一起孵育，在室温下以恒定的比例在5％脱脂奶粉或3％bsa / tbst中以1：1000的比例新鲜稀释。搅动。

5.用tbst将印迹的膜清洗3次，每次5分钟。

6.使用您选择的检测方法，例如ecl。

检测步骤

ι。活性cdc42 pull-down实验

1. 等分0.5-1 ml的细胞裂解物至微量离心管中。

2. 向管中加入1ml的1x assay/lysis 缓冲液。

3. 向管中加入1ul的活性cdc42单克l隆抗l体。

4. 用涡旋振荡仪将protein a/g凝胶柱充分混匀，然后快速的吸出20ul悬浮珠浆液加入离心管中。

5. 将管置于4°c条件下孵育1h，并轻轻的进行摇动。

6. 5000g，离心1分钟。

7. 弃上清，这一步要非常小心以避免珠子的损失。

8. 用0.5 ml的1x assay/lysis缓冲液洗涤珠子三次，离心并弃去上清。

9. 后一次洗涤后，小心的移去所有的上清。

10. 用20ul的2x sds-page样品缓冲液重悬样品。

11. 样品煮沸5min。

12. 5000g，离心10s。