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分子实验介绍——荧光检测

细胞荧光染色是以荧光物质标记而进行抗原定位的技术。在细胞中，通过特定的标记，可以检测目的蛋白表达量和表达定位。是细胞中的可直观观察细胞内蛋白定位和表达的实验方法。

实验流程：细胞固定-细胞膜破膜-蛋白封闭-目的蛋白结合-荧光二抗结合-dapi染色-荧光显微镜拍照或激光共-显微镜拍照。

结果示例：

细胞荧光染

通过观察细胞中蛋白的荧光强度和定位分析该蛋白的表达变化。

动物组织细胞基因组dna提取

操作步骤

1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g0.5cm3，尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶k

500ug/ml20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另

一离心管中。

2.加2倍体积异，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul te 重新溶解。可进行pcr反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行

3.加等量的酚??振荡混匀，离心12000 rpm，5min。

4.取上层溶液至另一管，加入等体积的?，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。

5. 取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/l氨加入2倍体积的无水---，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ,10min。

6.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。

7.用1ml 70%---洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ， 5min。

8.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。

9.加200ul te重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?c20℃保存备用。

10.吸取适量样品于genequant上检测浓度和纯度。

rna提取

1.弃去培养液，用pbs清洗两次1-2。

2.弃去pbs，用1000u1枪吸干净残余pbs。

3.加1ml trizol研磨b 41。

4. 1.5miep管标号与每孔相对应备用。

5.研磨好的溶液转移至对应的 ep管中国。

6.往每个ep管中加入250ul，剧烈震荡30s， 冰上静置12min[问l。

7. 所有样品4c离心，转速: 13500转1分钟，时间: 15min.

8. 再次标记一批同样编号ep管。

9.离心后吸上清液400u1移入相应编号的ep管中，再加入400ul异充

分混匀。4c冰箱35min。

10. 4c离心，转速: 13500转1分钟，时间: 10min.

11.弃去.上清液，加1m175%---，轻摇7]。

12. 4c离心，10600转/分钟，时间: 5min.

13. 弃上清液滤纸吸干。

14. 加depc水10ul溶解，-80c保存。进行逆转录前测浓度。

组织rna提取

1、剪米粒大小组织块放入ep管中标号。

2、ep管中加300ul trizol浸泡30分钟或更久。

3、用研磨棒研磨，以肉眼很难看到组织为宜。

4、加700u1 trizol静 置5分钟。