细胞生物学实验-系统模型【英瀚斯】

mtt检测

mtt 是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活xi胞线粒体中的---脱氢酶能使外源性 mtt 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒formazan并沉积在细胞中，而---无此功能。二jia基---dmso能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免yi检测仪在 570nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活xi胞数量。(6)未---完的软gu小块继续用ii型胶原酶如_上法---，直至软gu块基本消失。

透射电镜自噬小体检测

胰酶---，收集作用后的细胞，离心，先将细胞块固定在2.5%成二醛和0.1%的pbs溶液中保存在4c中过夜。

再用---梯度脱水，接下来用环氧树脂浸透并切成薄片。随后超薄切片用铜网固定，后用重金属---双氧---和柠檬酸铅染色。通过tem分析凋亡细胞内超微结构变化，拍照保存。

贴壁细胞:先倒出培养液，采用胰蛋白酶---或者用细胞刮(会产生碎屑)刮下:带培养液进行离心，100-1500/mim 5 10min。离心完毕倒出培养液。管底的细胞团不要打散， 沿管壁倒入适量(一般为材料体积的5-10倍)的2.5-3.5%成醒固定液，固定约1h-2h. 也可在4c冰箱过夜。7%的琼脂糖和2xdmem培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0。

三、自噬过程进行观察和检测

1、观察自噬体的形成

由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。phagophore的特征为:新月状或杯状，双层或多层膜,有包绕胞浆成分的趋势。自噬体(av1 )的特征为:双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(av2 )的特征为:单层膜，胞浆成分己降解。骨吸收陷窝在共培养7天后开始出现,随着培养时间的延长,陷窝面积呈增加趋势。( autophagic vacuolo av )

2、在荧光显微镜下采用gfp-lc3融合蛋 白来示踪自噬形成由于电镜耗时长，不利于监测(monitoring) 自噬形成，人们利用lc3在自噬形成过程中发生---的现象开发出了此技术。无自噬时，gfp-lc3融合蛋 白弥散在胞浆中;自噬形成时，gfp-lc3融合蛋白转 位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。6．加入辣根---化物酶结合的亲合素avi-hrp2μg/ml，37℃孵育30min，弃掉液体，pbs-t洗涤3次，每次3min。

3、利用western blot检测lc3-ii/比值的变化以评价自噬形成自噬形成时，胞浆型lc3 (即 lc3-i)会酶解掉一小段多肽，转变为(自噬体)膜型(即lc3-id，因此，lc3-ii/比值 的大小可估计自噬水平的高低。(注意: lc3对lc3-ii有更高的亲和力，会造成假阳性。方法2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。干细bao培养-分化干细bao是一类具有自我更新、高度增殖和多项分化潜能的细胞，理论上具有---分裂能力，在特定条件下，可分化成特定组织。)

4、mdc (monodansylcadaverine ，单丹---尸胺)染色:包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特---的。

5、celltrackertm green染色:主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特---的。

透射电镜观察:可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边.集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和调亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。

结果评判:调亡细胞体积变小，细胞质浓缩。调亡i期( pro-apoptosis nuclei)的细胞核内染色---度盘绕，出现许多称为气穴现象( cavitati)的空泡结构; iia 期细胞核的染色---度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生调亡小体。管底的细胞团不要打散，沿管壁倒入适量(一般为材料体积的5-10倍)的2。