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细胞实验介绍——慢---建立稳转细胞系

慢---包装：公司使用3质粒慢---包装系统，慢---系统使用plko.1-egfp、pspax2、pmd2.g，过表达慢---系统使用plvx-acgfp、pspax2、pmd2.g三质粒系统，将质粒混匀后使用磷酸钙转染方法转染至hek293t细胞中，培养48h后，收集上清。在长满的细胞培养板或者培养皿中，沿着中线使用移液器枪头或者其他硬物划1-3条平行的直线，去除中线的细胞，细胞在0h、12h、24h后，观察细胞往中线迁移情况，判断细胞迁移能力。使用genecopo公司慢---颗粒纯化试剂盒将慢---纯化。纯化后留取部分检测---滴度，其余---冻存于-80℃冰箱中。

滴度检测：将---颗粒使用梯度稀释，分别293t细胞，72h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况。根据细胞荧光量计算---滴度。

细胞：在---前---对细胞进行计数，接种约10000个细胞于12孔板中，培养过夜后使用无培养基稀释---，加入12孔板中对细胞进行，---数量根据细胞的moi加入若无moi，需做---梯度：1,5,10,50,100 5个梯度对细胞，6h后去除含---溶液，加入完全培养基细胞培养，培养48h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光强度。杂交瘤细胞基因测序杂交瘤细胞有丢失高特---高活性的风险，或者细胞状态不好乃至。同时加入puromycin对细胞筛选，筛选约2周时间。细胞筛选好后，使用定量pcr和western blot检测目的基因的稳定表达情况。

实验流程：慢---质粒构建-hek293t细胞培养-质粒转染293t细胞----收集----纯化----滴度检测-细胞-稳转细胞筛选-稳转细胞鉴定

结果示例：

                                               图 a ---滴度检测；b 目的细胞---效果图

细胞生物学服务

  南京英瀚斯生物科技公司自建有标准的细胞培养房，配备有生物安全柜、超净工作台、细胞三气培养箱、---细胞培养箱、荧光倒置显微镜、体视镜、、流式细胞仪等设备。破骨细胞标志基因trap在共培养3天时开始表达，而mmp-9和cathepsink则在共培养5天后表达结论共培养体系中成骨细胞对破骨细胞调控作用--的破骨细胞具有噬骨能力，该共培养模型可用于成骨细胞和破骨细胞之间的相互调控作用研究。细胞组---毕业于东南大学、华中科技大学等高校生物学相关，具有硕士研究生以上---，熟练掌握细胞学相关实验，可开展多种细胞实验。

 细胞elispot检测    

  1．培养板的预处理：在24孔培养板内加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，4h，弃掉板中的处理液，用pbs洗涤3次，每次3min；

     2．抗原包被：将适量抗原溶于包被缓冲液中，每孔加入0.5ml，4℃过夜，pbs-t洗涤3次，每次3min；

     3．制备细胞悬液：将待测已致敏小鼠处死，取出pi脏，置于加有hanks液的平皿内，用钝头直角9号zhu射器针头破少许脾被膜后，赶出细胞，用毛细吸管轻轻吹散细胞团后，将悬液通过250目尼龙网，取滤液，1000r/min离心5min，hanks液洗涤3次，计数细胞后，用1640液重新悬浮细胞，配成所需浓度；(4)再次用pbs缓冲液冲洗3次，滤干，将细小的软gu块置入放有0。

     4．往各孔中加入0.5ml含不同浓度104-106/ml的细胞悬液，置37℃，5％co2条件下孵育2-4h，弃掉培养液，pbs-t洗涤3次，每次3min；

     5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗tibio-ab2μg/ml，37℃孵育1h或4℃过夜，弃掉液体，pbs-t洗涤3次，每次3min；

     6．加入辣根---化物酶结合的亲合素avi-hrp2μg/ml，37℃孵育30min，弃掉液体，pbs-t洗涤3次，每次3min；

     7．配制明胶-底物液：在37℃水浴中，将2.5mltmb溶液4mg/ml  jia醇溶液滴加入7.5ml10%明胶溶液用ph5.0磷酸钠-柠檬酸缓冲液配制边加边搅，溶液呈白色，加入14μl 3% h202；

     8．显色与计数：将培养板底冰浴，每孔加入0.6ml明胶-底物液，约3min，混合液凝固，将培养板取出，置室温5min，将板倒置，用肉眼和低倍放大镜计数所显示出的颜色的斑点。

成纤维细胞分离方法

1.处死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪开，用另外- -组剪刀、镊子剪开腹部肌层，露出，后用第三组剪刀和镊子将小心取出放在盛有d-pbs的玻璃平皿中，冲洗去血。

2.用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30 ml d-pbs的50 ml离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉d-pbs,再重复此步骤一次，注意要留少许d-pbs，然后将胚胎转移到另- -装有d-pbs的平皿中，并用手术刀片将其细细切碎。(4)缓慢将细胞悬液加入预先装有5ml淋巴细胞分离液的15ml离心管内，保持细胞悬液在淋巴细胞分离液上层，注意不要搅动液面,保持二者分层界面。

3. 用200 μ的移液枪反复、快速地吹打平皿中的液体，转移至15 ml离心管中，于4c 1500 rpm离心5分钟，倒掉上清，以10 ml胰酶重悬沉淀，放在37c水浴中---30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分---。

4.将上层细胞悬液倒入一个装有10 ml mef生长培养基的50 ml离心管中，用200目的尼龙网过滤后，以1500 rpm离心5分钟收集细胞，再用30 ml mef生长培养基洗涤两次。

5.细胞沉淀用15 ml mef生长培养基重悬后进行细胞计数(- -般8只14天的胎鼠可获得2-3x107细胞)。

6. 3x106细胞悬浮于15 ml mef生长培养基中，接种到200 ml培养瓶中。

7. 24小时后更换新鲜的mef生长培养基。

8.细胞长满后，先用d-pbs冲洗，倒掉后加胰酶---(此步时间不宜过长，作者- -般不超过五分钟)，按1:5传代。

9. 细胞再次长到覆盖率80-90%左右， 将其---后，常规冻存(冻存液要现配)。