FISH检测分子生物学检测,英瀚斯生物科技

聚合酶链式反应(pcr)

操作步骤

1.在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。

1qpcr buffer

5 μl

dntp mix( 2mm )

4 μl

引物1(10pm)

μl 2

引物2 ( 10pm)

2μl

taq酶(2u/ul)

1 μl

dna模板( 50ng-1μg/μl )

加ddh2o至

μl 50

视pcr仪有无热盖,不加或添加石蜡油。

2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心,立即置pcr仪上执行扩增。-般:在93°c

预变性3-5min ,进入循环扩增阶段: 93°c 40s***58°c 30s***72°c 60s ,循环30-35

次，后在72°c保温7min。

3.结束反应, pcr产物放置于4°c待电泳检测或-20°c长期保存。

4. pcr的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100ul进行抽提反应混合液,以

除去石蜡油;否则,直接取5- 10μl电泳检测。

rip

技术概述

rip是研究体内蛋白与rna互作的重要技术。-般:在93°c预变性3-5min,进入循环扩增阶段:93°c40s***58°c30s***72°c60s,循环30-35次，后在72°c保温7min。该技术先用甲醛等试剂交联细胞内的“蛋白-rna”互作复合物，裂解细胞后，用靶蛋白特异的抗l体(或标签抗l体)做免l疫沉淀，获得“靶蛋白-rna”互作复合物，去交联分离其中的rna;针对预测的靶蛋白结合rna的序列设计引物，

做qpcr实验，验证预测的rna是否与靶蛋白有结合，或者将分离出来的rna做高通量测序，筛选到可能与靶蛋白结合的rna。

技术流程

细胞交联-***细胞裂解-***免l疫共沉淀***去交联***rna分离***建库***高通量测序(或qpcr)。

在玻璃烧杯中注入去离子水，加入depc使其终浓度为0.05%~0.1%depc-h2o。depc二焦---为活性很强的物，须在通风橱中小心使用

将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入depc-h2o，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通风柜中37℃ 或室温下处理过夜。

将depc-h2o小心倒入废液瓶中，将装有depc- h2o 处理过的塑料制品的容器以铝箔封口，高温高压蒸汽灭菌至少30分钟。

灭菌塑料制品烘烤干燥，置洁净处备用。

玻璃和金属物品250 ℃烘烤3小时以上。