PCR检测裸鼠成瘤模型,英瀚斯

dna测序检测

1. pcr测序反应

(1)取0.2ml的pcr管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂:

所加试剂测定模板管标准对照管

bigdye mix

1μl

待测的质粒dna

1μ 1

pgem-3zf (+)双链dna

-1μ1

待测dna的正向引物

m13(-21)引物- 1μ 1

灭菌去离子水

2μ 1

总反应体积5μ 1,不加轻矿物油或石蜡油，盖紧pcr管，用手指弹管混匀，稍离心。

(2)将pcr管置于9600或2400型pcr仪.上进行扩增。98c变性2min后进行pcr循环，

pcr循环参数为96c 10s， 50c 5s， 60°c4min， 25 个循环，扩增结束后设置4c保温。

2.---法纯化pcr产物

(1) 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml ep管中。

(2)加入25μ 1/---混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀dna。12 000r/min于

4c离心30 min,小心弃上清。

(3)加70%(v/v)的---50μ 1 洗涤沉淀2次。12 000r/min 于4c离心5min,小心弃上清和

管壁的液珠，真空干燥沉淀10~ 15min。

3.电泳前测序pcr产物的处理。

(1)加入12μ 1的tsr于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解dna沉淀，稍离心。

(2)将溶液转移至盖体分离的0.2ml pcr管中，稍离心。

(3)在pcr仪上进行热变性(95c 2min),冰中骤冷，待_上机。

4..上机操作按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立

运行的测序顺序文件。

5.仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过

序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。

6.测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。

蛋白提取

大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液, 少数与脂类结合的蛋白质则溶于---、---等有ji溶剂中，因些，可 采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。

(一)水溶液提取法

稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质常用的溶剂,通常用量是原材料体积的1-5倍,提取时需要均匀的搅拌,以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。该技术先用甲醛等试剂交联细胞内的“蛋白-rna”互作复合物，裂解细胞后，用靶蛋白特异的抗l体(或标签抗l体)做免l疫沉淀，获得“靶蛋白-rna”互作复合物，去交联分离其中的rna。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度-于溶 解，缩短提取时间。但另一方面. ,温度升高会使蛋白---性失活,因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温( 5度以下)操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白 水解酶抑zhi剂(如二yi------,碘yi酸等)。

蛋白质双向电泳实验流程

1.---yi酸-bing酮沉淀法提取蛋白

2.双向电泳分离待测样品

(1)一相等电-前处理按照所用仪器的厂商提供操作手册进行。蛋白质上样浓度不要超过10mg/ml,否则会造成蛋白质的---或沉淀。

(2)等电-完毕后(约需24hr，若不立即进行第二相电泳，胶条可夹在两层塑料薄膜中于-70℃保存数月。

(3)等电-好的胶条按厂商提供的操作手册平衡两次。平衡完毕后，于电泳仪上用12.5%sds-page凝胶进行电泳分离。仪器设置为2.5w/胶 45min，15w/胶 5-8hr，20℃。

3.银染法对凝胶进行染色

(1)固定(2)清洗(3)增敏(4)清洗(5)染色(6)清洗(7)显影(8)定影(9)水洗

3.凝胶扫描及图像分析

(1)图像扫描：凝胶染色后采用image scanner以300dpi，16-bit模式65536灰阶进行扫描。

(2)图像分析：扫描完毕后，凝胶继续置于1%yi酸中于4℃保存。(2)加入25μ1/---混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀dna。扫描后的图像用imagemaster 2d platinum software软件进行分析。分析按照软件厂商提供的说明书进行。以zui小点面积30，平滑度2为主要参数zui大限度检测蛋白质点。以目标蛋白质3个重复具有相同趋势，目标蛋白质相邻位点的相对一致性，至少2个重复有2倍以上差异作为判定差异表达蛋白质的标准。