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蛋白提取

大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液, 少数与脂类结合的蛋白质则溶于-、-等有ji溶剂中，因些，可 采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。

(一)水溶液提取法

稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质常用的溶剂,通常用量是原材料体积的1-5倍,提取时需要均匀的搅拌,以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度-于溶 解，缩短提取时间。但另一方面. ,温度升高会使蛋白质变性失活,因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温( 5度以下)操作。上机操作按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白 水解酶抑zhi剂(如二yi--,碘yi酸等)。

3.引物的od数如何定量？

答：引物合成引物od数是这样测定的：用紫外分光光度计，波长260nm，石英比色杯，光程为1厘米，测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度好稀释到0.2-1.0之间。dna干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用1ml水稀释测od值。需要根据稀释倍数换算出母液的od值。在检测rna结合蛋白时，依据目的rna结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。

4.需要什么级别的引物？

答：引物常用的纯化方式脱盐、biorp / opc纯化、page纯化、hplc纯化。根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。

15.测序发现引物有突变是怎么回事？

答：测序发现引物区域有突变，-是40个碱基以下的引物, 发生的概率不大，但是肯定也会发生。用户一般可以放心，引物序列一般都是通过电脑直接将您的序列copy到合成仪的，碱基输错的机会不多。-合成公司一般会有一套控制办法，预防碱基输入错误。发生这种突变的原因有很多解释，人们还没有办法解决这个问题。目前公司可为您提供反转录pcr、荧光定量pcr、凝胶电泳迁移率等检测服务，大大缩短您的实验周期、降低您的实验成本。引物合成的固相合成原理都一样，采用的机器也基本相同，合成主要原料都是由可数的几家跨国公司提供的，所有每个合成服务商遇到的问题也基本类似，没有人可以超脱。

引物合成是一种多步骤的化学反应，合成也就是99%，副产品不可以避免。引物序列中插入突变往往是碱基重复，一般认为，偶连过程中，正在偶连的部分单体发生丢失dmt,导致单体又接了上去，故发生插入同一碱基的突变。至于缺失突变，一般认为是一般认为是带帽(capping)反应不造成的，caping反应主要是封闭数5′--没有参加反应单体。-闭的引物，在下一轮偶连时将不能继续参与合成。对于碱基置换的突变，产生的原因一般认为是碱基不能100%脱保护，即引物上可能含有残留保护基团，引物的这些区域不能-地与互补链配对，当扩增的产品被亚转化到大肠中，可能被-中修复系统补上了非配对的碱基。置换突变通常发生在g 转换成其它碱基。碱基g在一定条件下可以转化为烯醇异构体 脱呤，2,6 diaminopurine , dna和扩增过程中dna聚合酶将2,6 diaminopurine看作碱基a，测序就会发现碱基g-a置换。脱呤现象在富含呤的引物中发生的频率较高。这一新产品将可捕获64m的基因组序列，包括外显子以及mirna，它含与其他nimblegen液相捕获产品相同的2。脱呤的引物在引物后处理脱保护阶段如果被降解，测序就会发现碱基g或a的缺失。

引物合成过程中，造成碱基插入，缺失，置换突变的因素客观存在，有不少降低发生的频率建议和措施，但是这些措施还停留在实验室阶段，还没有能够应用到规模化生产中。