RAB5C KIT信息「多图」

1.---的和非---的细胞裂解液

2.蛋白酶抑l制剂

3. 4°c管摇杆或摇床

4. 0.5 m edta，ph8.0

5. 1 m氯---

6. 2倍还原sds-page样品缓冲液

7.电泳和免l疫印迹系统

8.免l疫印迹洗涤缓冲液，例如tbst10 mm tris-hcl，ph 7.4，0.15 m nacl，0.05％

吐温20

9.免l疫印迹封闭缓冲液tbst包含5％脱脂奶粉或3％bsa

10. pvdf或硝l酸纤维素膜

11.二抗

12. ecl检测试剂

电泳和转膜

1. 取15ul样品/孔上样17%配体胶。

2. 按照制造商的说明进行sds-page。

3. 按照制造商的说明将凝胶蛋白转到pvdf或硝化纤l维素膜。

免l疫印迹反应和检测所有步骤都是在室温下进行，并不断搅拌

1. 将pvdf膜浸入100%甲l醇15s，然后在室温放置5 min晾干。

注意：如果使用的是硝化纤l维素膜，此步省略。

2. 封闭：用tbst缓冲液配制5%的脱脂牛奶或者3%bsa在室温下孵育1h进行封闭，并需要恒定振荡。

3. 孵育一抗：用tbst缓冲液配制的5%脱脂牛奶或3%bsa稀释特---识别cdc42活性构象的兔多克l隆抗l体稀释比例为1:50-1:1000，主要根据样品中含有的cdc42蛋白的量，室温下孵育1-2小时，或者4°c条件下过夜孵育。

4. 用tbst缓冲液洗涤膜三次/5min。

5. 孵育二抗：例如羊抗兔igg-hrp，用tbst缓冲液配制的5%脱脂牛奶或3%bsa按1:1000稀释比例稀释后使用，室温下孵育1小时并恒定振荡。

6. 用tbst缓冲液洗涤膜三次/5min。

7. 使用实验者所选择的检测方法进行显色如ecl显色法。

gα13活化试验。mef细胞分别用lpa第2道或不加lpa1道处理。细胞裂解物用抗活性gα13单克l隆抗l体cat孵育。#26902顶面板。这个用抗gα13兔多克l隆抗l体cat免l疫印迹法检测沉淀活性gα13#21005年。底部的面板显示了用抗gα13的细胞裂解物的western blot5%在顶部面板中使用的。