金华荧光定量PCR质粒构建 英瀚斯

分子实验介绍——荧光检测

细胞荧光染色是以荧光物质标记而进行抗原定位的技术。在细胞中，通过特定的标记，可以检测目的蛋白表达量和表达定位。是细胞中的可直观观察细胞内蛋白定位和表达的实验方法。

实验流程：细胞固定-细胞膜破膜-蛋白封闭-目的蛋白结合-荧光二抗结合-dapi染色-荧光显微镜拍照或激光共-显微镜拍照。

结果示例：

细胞荧光染

通过观察细胞中蛋白的荧光强度和定位分析该蛋白的表达变化。

基因组甲l基化水平(methyl ati on content)的分析:

1.高l效液相色谱(hi gh-performanceli qui dchromatography, hplc)hplc是- -种比较传统的方法,是根据dna或蛋白分子量和构象的不同而使其加以分离。由于在动态相和静态相下分子的光吸收度并不相同而加以定量。随着系统的压强的增加，其分辨率增l高。故而能够定量测定基因组整体水平dna甲l基化水平。该方法由ruo等1980年首l次-。过程是将dna样品先经-或氢l氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，结果与标准品比较，用紫外光测定吸收峰值及其量，计算5 mc/(5mc+5c)的积分面积就得到基因组整体的甲l基化水平。这是一种检测dna甲l基化水平的标准方法。筛选出差异表达的lncrna是研究其在人类-发生中所扮演角色的基础。

2.高l效毛细管电泳法(hi gh-per formance capillary electrophoresis, hpce)这是一-种利用窄孔熔融石英毛细管来从复合物中分离不同化学组分的技术。其基础是在强电场下不同分子的由于其所带电荷，大小，结构以及疏水性等不同而相互分开。用hipce方法处理dna水解产物来确定5mc水平，简便，经济且敏感性高。lncrna和mrna同时检测：芯片上包含有的lncrna和新的mrna序列检测探针。

rna提取及注意事项

研究基因的表达和调控时，需要从组织或细胞中分离纯化rna。rna的高低经常影响rt-pcr、cdna库构建和northern blot等分子生物学实验的成败。

主要试剂

trizol是一种新型总rna抽提试剂，内含异-胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的-酶。

1.

trizol试剂含有，具有毒性和-性，注重操作。

2.

rnase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉，注重配带手套，样品尽可能盖严。

3. 细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低后得率，因为一部分rna会残留在未裂解的细胞中。细胞裂解之后要看不见颗粒状物质结缔组织和骨除外。在清洗和裂解细胞时在低温下操作，防止在操作过程中释放的内源rnase降解了rna。

4. 酵母和一些-由于细胞壁的-结构，可以加入trizol试剂同时加入无rnase的玻璃珠并剧烈振荡，使细胞裂解充分。

2-8℃ 避光保存一年。