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大鼠shen小球内皮细胞分离培养

2.原代细胞培养:(1)shen脏原位灌洗:sd大鼠用25%乌拉坦腹整注-zui后仰卧固定。胸腹部消森并分离胸主动脉,以无菌的冷hank液漱朱洗血.同时剪破shen静脉利于液体流出。1-2min后shen脏色泽变白,取出双shen冰浴保存。自噬形成时，gfp-lc3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。

(2)shen小球分离:参照green等方法改进。将灌洗后的shen脏撕下shen被膜.去除髓质后将皮质剪成约1-2mm的碎块，轻碾shen皮质依次通过80.120和200目钢筛。收集shen小球。

(3)shen小球---和培养；将提取的shen小球加人0.1% in 型胶原酶---后收集沉淀。以2x10* 的shen小球数接种于铺有1%明胶培养瓶内,加a配制好的内皮细胞培养液(mfm.hepes 20 mmnovl 20%胎牛xue清0. 66 u---/ml.血管内皮生长因子20 ng /ml、---钠100 u/ml.青莓su100 u/ml、链霉su100 μ/ml) .静止培养3 d后逐日观察shen小球的贴壁情况。待shen小球充分贴壁后常规换液.第3同进行纯化。其检测原理为活xi胞线粒体中的---脱氢酶能使外源性mtt还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒formazan并沉积在细胞中，而---无此功能。

选择实验外包公司需要注意哪些事项？

技术支持

尽量有专门的技术负责对接项目，或者有技术服务群。---沟通项目问题，定期-实验进展。这样能把控实验进度，结果数据有疑问也可以交流，不要实验做完就没人管了。

实验数据

明确提供实验原始数据、原始图片，并有保密协议不外传数据和客户的信息。---实验结果的完整性、唯独性、真实性。这也是找实验外包很关心的原则。另外结果尽量有实验报告形式，包含所用材料、实验步骤和结果统计分析，方便写文章时直接使用。另外实验都是有不确定性的，如果外包公司能---一定能做出预期的结果，那多半是不---的。因组织细胞内无内源性brdu存在，所以brdu应用较广掺入双链dna内的brdu,以氢链与腺呤结合，不能直接与抗brdu反应，需经解链使brdu暴露方能被染色。做实验不怕出问题，的外包公司会负责到底，有问题反馈再处理就好。

q:中的沉淀物对细胞培养有什么影响？

a:1细胞生长，我们的试验以及经验表明沉淀物不会影响细胞培养，我们的客户以及其它生产商也证明了这一点。

2过滤，如果中出现大量的沉淀物，将很难过滤。一般说来，因为在生产工序中已经过 100nm 或者 40nm 的过滤处理，并且经过了严格的无菌检测，因此不再过滤用于细胞培养 的。在实验室中没有---再过滤处理，在-的细胞培养中往往将直接加到培养基中一起 过滤。------是指同一来源的细胞逐渐产生出形态结构、功能特征各不相同的细胞类群的过程，其结果是在空间上细胞产生差异，在时间上同一细胞与其从前的状态有所不同。

3污染，磷酸钙往往被误认为微生物污染而引起。研究者可能会在中观察到一些絮状的 沉淀，因此就会比较警觉的去做无菌试验，将放在培养箱中培养几天，结果可能会观察到更多的絮状 沉淀，因此就断定被污染了。并且当研究者将样品放在倒置显微镜下观察时往往可以看到一些可 以运动的小黑点，因此就确认是被污染了。于是，研究者就会花费更多的时间和精力来和生产商 确认，但终确定没有被污染而只是沉淀。为了避免这些问题的发生，我们建议不要直接将放在 培养箱中培养观察是否有菌，而是将加到琼脂板上进行培养以观察是否有---生长。常用的染色法包括台盼蓝、橙/化乙啶ao/eb、giemsa和he法等。另外，也可以进 行革兰氏染色，在油镜下观察，以确认是否有污染。

关于细胞冻存的注意事项：

1.  为保持细胞大存活率，一般都采用慢冻存融的方法。

2.  冻存物距液氮面越近温度越低。标准的低冻速度为－1℃~12℃/ 分钟，当温度下降达－25℃时，下降速度可增至－5~－10℃/ 分钟，到－100℃时则可迅速冻入液氮中。因此要适当掌握冻存物下降入液氮中的速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则促冰晶形成。通常利用annexinv-fitc和碘化丙啶(pi)来区分凋亡和坏---。

3.  初次冻存者在下降冻存时，宜先用细木棒伸入罐中探测液面位置，然后需用温度计与冻存物并行的办法，以观测下降冻存物的速度、冻存物与液氮液面距离和温度三者关系，当已掌握以上各参数和冻存技术熟练后，仅按下降时间和下降距离便可获理想冻存效果。