PCR预混液-「友名生物」

污染的监测

一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。

1、阳性对照：在建立pcr反应实验室及一般的检验单位都应设有pcr阳性对照，它是pcr反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高100个拷贝以下。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一pcr试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。

2、阴性对照：每次pcr实验务必做阴性对照。它包括：

  1标本对照：被检的标本是血1清就用鉴定后的正常血1清作对照；被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。

  2试剂对照：在pcr试剂中不加模板dna或rna,进行pcr扩增，以监测试剂是否污染。

3、重复性试验。

4、选择不同区域的引物进行pcr扩增。

反向pcr( inverse pcr, ipcr术

原理:反向pcr是克1隆已知序列旁侧序列的一种方法，主要原理是用一种在已知序列中无切点的-性内切酶-基因组dna.后酶切片段自身环化.以环化的dna作为模板，用一对与已知序列两端特-结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的dna的部分片段，大小取决于.上述-性内切酶在已知基闲侧翼dna序列内部的酶切位点分布情况。用不同的-性内切酶-，可以得到大小不同的模板dna，再通过反向pcr获得未知片段。

该方法的不足是:需要从许多酶中选择-酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的dna部分片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶dna。大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在yac或cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向pcr得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。

不对称pcr(asymmetric pcr枝术

两种引物浓度比例相差较大的pcr技术称不对称pcr.在扩增循环中引入不同的引物浓度.常用50~ 100+1比例。在起初的10~ 15个循环中主要产物还是双链dna.但当低浓度引物被消耗尽后。高浓度引物介导的pcr反应就会产生大量单链dna.

应用:可制备单链dna部分片段用于序列分析或-杂交的探针。

反转录pcr(reverse transc ription, rt- pcr技术

当扩增模板为rna时。需先通过反转录酶将其反转录为cdna才能进行扩增。rt - pcr应用非常广泛。无论是分子生物学还是-检验等都经常采用。

修饰引物pcr技术

为达到某些特殊应用目的.如定向克1隆、定1点突变、体外转录及序列分析等。可在引物的5*-端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分析结合位点等。

随机引物扩增技术(arbitrary primedpcr, ap- pcr)

ap-pcr技术通过随意设计或选择一个非特-引物.在pcr反应体系中.首先在不严格条件下使引物与模板中许多序列通过错配而复性。如果在两条单链上相距一定距离有反向复性引物存在,则可经taq酶的作用使引物延伸而发生dna部分片段的扩增。经一至数轮不严格条件下的pcr循环后，再于严格条件下进行扩增。扩增的产物经dna测序凝胶电泳分离后.经放1射性自显影或荧光显示即可得到dna指纹图。ap-pcr用于肿1瘤的抑制基因、癌基因的分离;菌1种、菌株及不同物种的鉴定;遗传作图;不同分化程度或某些不同状态下的组织的基因表达差异等方面的研究。