流式细胞高通量测序检测「英瀚斯」

细胞实验介绍——流式细胞术检测细胞周期和凋亡

流式细胞术检测细胞周期：

细胞周期：指细胞从-次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由g0/g1期、s期、g2期和m期组成。干细bao培养-分化干细bao是一类具有自我更新、高度增殖和多项分化潜能的细胞，理论上具有-分裂能力，在特定条件下，可分化成特定组织。g0/g1期：有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，进入下一个细胞周期，或者进入静止期g0期，而g0期从dna含量上无法与g1期区分，细胞开始rna和蛋白质的合成，但dna含量仍保持二倍体。s期：dna开始合成，细胞核内dna的含量介于g1期和g2期之间。g2期和m期：当dna成为4倍体时，细胞进入g2期。g2期细胞继续合成rna及蛋白质，直到进入m期。

pi法是-的周期检测方法。细胞实验介绍——慢-建立稳转细胞系慢-包装：公司使用3质粒慢-包装系统，慢-系统使用plko。pi为插入性-荧光染料，能选择性的嵌入-dna和rna双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与dna的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的dna分布状态，从而计算出各个期的百分含量。

一般流程：细胞收集-70%酒精固定过夜-pi染色-流式细胞仪检测。

细胞凋亡：细胞凋亡的早期就有细胞膜表面破损发生。破损时凋亡细胞表面的磷脂腺丝氨酸(ps)可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜。集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和调亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。该过程发生在之前，检测ps的表达，能反映早期凋亡。annexinv是ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对ps有-的亲和性，并且可以与暴露于细胞外的ps相结合。利用这一原理，可以将annexinv标记荧光来识别早期的细胞凋亡。通常利用annexinv-fitc和碘化丙啶(pi)来区分凋亡和坏-。pi的膜通透性很差，因而只能标记坏死的细胞。

一般流程：细胞收集-pi-annexinv标记-流式细胞仪检测。

结果示例：

                                   图 a 细胞周期检测图；b 细胞凋亡检测图

自噬流检测

自噬是调节真核细鹏生长、和能量代谢的重要生物学机制。4、脂质体5ul补培养基至50ul混匀静止5分钟(质粒与脂质体比例为1:2或1。细胞自噬行使其生物学功能的前提是自噬流的话化。大量证据表明自噬流受损与多种慢性炎性-，-是、神经退行性-及组织纤维化的发病密切相关，目前对于自噬液的检别是自噬与其相关-研究领域的-。由于自噬流是一个曲多个步骤组成的动态过程。因此往需要精细的突验才能准确判断自啦流状态。

三、自噬过程进行观察和检测

1、观察自噬体的形成

由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。结果:30%percoll密度梯度离心前cd117(c-kit)阳性细胞占13。phagophore的特征为:新月状或杯状，双层或多层膜,有包绕胞浆成分的趋势。自噬体(av1 )的特征为:双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(av2 )的特征为:单层膜，胞浆成分己降解。( autophagic vacuolo av )

2、在荧光显微镜下采用gfp-lc3融合蛋 白来示踪自噬形成由于电镜耗时长，不利于监测(monitoring) 自噬形成，人们利用lc3在自噬形成过程中发生-的现象开发出了此技术。yao物对细胞的ic50检测ic50(halfmaximalinhibitoryconcentration)是指被测量的拮抗剂的半抑制浓度。无自噬时，gfp-lc3融合蛋 白弥散在胞浆中;自噬形成时，gfp-lc3融合蛋白转 位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。

3、利用western blot检测lc3-ii/比值的变化以评价自噬形成自噬形成时，胞浆型lc3 (即 lc3-i)会酶解掉一小段多肽，转变为(自噬体)膜型(即lc3-id，因此，lc3-ii/比值 的大小可估计自噬水平的高低。这是由于zhongt瘤细胞自身可分泌多种生长因子，-血管生成。(注意: lc3对lc3-ii有更高的亲和力，会造成假阳性。方法2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。)

4、mdc (monodansylcadaverine ，单丹-尸胺)染色:包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特-的。

5、celltrackertm green染色:主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特-的。

大鼠脂肪的分离

 将手术切取的大鼠脂肪组织尽量剪碎后移至离心管，其余步骤与人脂肪的分离一致。

 经手术切除获得的大鼠皮下脂肪组织-后原代培养24 h，且肉眼观察会发现培养瓶底部贴附着一层网状薄膜，轻轻摇晃培养瓶可使这层网状薄膜从瓶壁上脱落，镜下观 察发现大部分细胞都附着于这层膜上，通过术获取的人脂肪组织-后则无此现象。增加胶原酶的量和-时间也无法避免，取材时的或脂肪间结缔组织未被完全-，穿过细胞筛进入了培养瓶并沉淀于瓶底部形成的。2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10ml37预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。胶原蛋白酶虽然可以特-水解胶原蛋白的三维螺旋结构，但不会损伤其他蛋白质。处理方法是37 ℃下用胰蛋白酶 -5 min。然后利用40 μm的细胞筛过滤后传代。 根据作者的经验，每毫升手术切除的大鼠脂肪可分离基质血管成分细胞约1.81×106个。原代培养2.24×107个大鼠基质血管成分细胞，40 h后传代时约剩余 6.2×106个细胞，细胞剩余率27%。