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发布者：武汉思特进科技发展有限公司时间：2021-11-16

原位杂交技术基本原理

原位杂交技术的基本原理是利用---分子单链之间有互补的碱基序列，将有放6射性或非放6射性的外源---(即探针)与组织、细胞或染色体上待测dna或rna互补配对，结合成专一的---杂交分子，经一定的检测手段将待测---在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。

为显示特定的---序列必须具备3个重要条件：组织、细胞或染色体的固定、具有能与特定片段互补的核苷酸序列(即探针)、有与探针结合的标记物。

在条件都得到满足的情况下，杂交的成败就取决于保温时间。时间短了，杂交反应不完成；时间长了也无益，会引起非特异结合增多。一般杂交反应要进行20h左右。1966年britten和kohne用cot =值来计算杂交反应时间。cot 值实际上是杂交液中单链起始浓度co和反应时间t的乘积。实验表明cot =100时，杂交反应基本完成。cot=0，基本上没有杂交。例如在液相杂交中未标记的dna 400μg/ml按单股dna每微克紫外吸收值为0.024计算，总的吸收值为 9.6，如果反应时间为21h，那么对于未标记的dna来说，cot =9.6/21 =100.8,，杂交完成了。对标记dn a浓度为0.1μg/ml来说cot值为0.05，这就充分排除了标记dna的自我复性。tm值25℃时杂交zui佳，所以首先要根据公式4计算杂交体tm 值。由此式可见，通过调节盐浓度、---胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性。

在选择探针类型的同时，还需要选择标记方法。探针的标记方法很多，选择什么标记方法主要视个人的习惯和可利用条件而定。但在选择标记方法时，还应考虑实验的要求，如灵敏度和显示方法等。一般认为放0射性探针比非放0射性探针的灵敏度高。放0射性探针的实际灵敏度不依赖于所采用的标记方法，如随机引物延伸法往往得到比缺口平移法更高的比活性。在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效0率0高、显示灵敏的探针标记方法。在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和比较稳定的碱性磷酸酶显示系统。

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