G蛋白活性检测试剂盒纽斯特 武汉纽斯特生物

1. vasp通过调节rab11依赖性tgf-β受体的质膜靶向来促进肝星状细胞的tgf-β活化

    肝l病学第61卷，首1期，第361-374页，2015年1月

2. rab5活性调节glut4分类为-反应性和非-反应性内体室：-抵抗发展的潜在机制。

    内分l泌学。 2014年9月; 1559：3315-28

将裂解液转移到适当大小的试管中，并置于冰上。

如果发生核裂解，则细胞裂解液可能变得非常粘稠，难以移液。 如果发生这种情况，可将裂解液通过27?号注射l器针头3-4次以剪切基因组dna。

通过离心10分钟在4°c下为12,000 x g清除裂解物。

收集上清液并将样品保存在冰上以备立即使用，或速冻并保存在-70°c以便将来使用。

小g蛋白是从属于细胞调节因子中的一个超家族。rho家族是小g蛋白中的一个亚家族，它在细胞运动、细胞分裂以及基因转录中发挥主要作用。而本试剂盒中的cdc42就属于rho亚家族中的一种， cdc42参与生理活动过程中其分子结构会呈现出2种相互转换的形式：与gtp结合的激l活状态和与gdp结合的非活性状态。

目前cdc42蛋白活性的检测主要是依据小gtp酶cdc42可以与p21活化激酶pak的p21结合区域pbd结合，使pak活化从而发挥生物学功能，进而间接的进行cdc42活性l功能的监测。然而此方法在检测过程中存在着一定的局限性比如gtp水解成gdp的速度过快以及cdc42-gtp结合蛋白与p21结合区域之间较低的亲和力，导致这种检测方法的重复性较差。

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悬浮细胞

1.培养细胞并根据需要用活化剂或抑制l剂-。

2.进行细胞计数，然后通过离心沉淀细胞。

3.吸出培养基，并用冰冷的pbs洗涤两次。

4.完全除去pbs洗涤液，然后向细胞沉淀中加入冰冷的1x分析/裂解缓冲液

   每1 x 107池0.5 – 1 ml。

5.通过重复移液裂解细胞。

6.将裂解物转移至适当大小的试管中，并置于冰上。

7.如果发生核裂解，则细胞裂解液可能变得非常粘稠，难以移液。如果这

   发生时，裂解液可通过27?号注射l器针头3-4次以剪切

   基因组dna。

8.通过离心10分钟在4°c下为12,000 x g清除裂解物。

9.收集上清液并将样品保存在冰上以备立即使用，或速冻并保存在-

   70°c以备将来使用。

阳性和阴性对照的体外gtpγs/ gdp蛋白质上样量

    注意：体内-细胞会激l活大约10％的可用rab35，而

    体外gtpγs蛋白负载将激l活近90％的rab35。

1.将0.5 ml每种细胞提取物等分到两个微量离心管中或使用1 μg纯化的rab35蛋白。

2.向每个试管中加入20 μl 0.5 m edta至20 mm终浓度。

3.将5 μl 100 xgtpγs至100 μm，终浓度加到一个试管中阳性对照。

4.在第二个试管中加入5 μl 100 x gdp至1 mm，终浓度阴性对照。

5.在搅拌下将试管在30°c孵育30分钟。

6.通过将试管放在冰上并添加32.5 μl 1 m mgcl2至60 mm。