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转录组测序

转录组即某个物种或特定细胞在某一功能状态下产生的rna的总和，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。不同个体之间在一个同源str位点的重复次数也不同，因而同指纹识别一样，str位点分析也可对个体进行身份识别。与基因组不同的是，转录组的定义中包含了时间和空间的限定。同一细胞在不同的生长时期及生长环境下，其基因表达情况是不相同的。转录组测序rna-seq是指利用第二代高通量测序技术进行cdna测序，快速地获取某一物种特定qi官或组织在某一状态下的转录本。相对于传统芯片而言，rna-seq无需预先设计探针，即可对物种的细胞类型的转录组进行检测，能够提供较的数字化信号，更高的检测通量以及更广泛的检测范围，是目前深入研究转录组复杂性的-工具。

dna测序检测

1. pcr测序反应

(1)取0.2ml的pcr管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂:

所加试剂测定模板管标准对照管

bigdye mix

1μl

待测的质粒dna

1μ 1

pgem-3zf (+)双链dna

-1μ1

待测dna的正向引物

m13(-21)引物- 1μ 1

灭菌去离子水

2μ 1

总反应体积5μ 1,不加轻矿物油或石蜡油，盖紧pcr管，用手指弹管混匀，稍离心。

(2)将pcr管置于9600或2400型pcr仪.上进行扩增。98c变性2min后进行pcr循环，

pcr循环参数为96c 10s， 50c 5s， 60°c4min， 25 个循环，扩增结束后设置4c保温。

2.-法纯化pcr产物

(1) 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml ep管中。

(2)加入25μ 1/-混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀dna。12 000r/min于

4c离心30 min,小心弃上清。

(3)加70%(v/v)的-50μ 1 洗涤沉淀2次。12 000r/min 于4c离心5min,小心弃上清和

管壁的液珠，真空干燥沉淀10~ 15min。

3.电泳前测序pcr产物的处理。

(1)加入12μ 1的tsr于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解dna沉淀，稍离心。

(2)将溶液转移至盖体分离的0.2ml pcr管中，稍离心。

(3)在pcr仪上进行热变性(95c 2min),冰中骤冷，待_上机。

4..上机操作按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立

运行的测序顺序文件。

5.仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过

序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。

6.测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。

单细胞rna测序

单细胞rna测序也称scrna-seq。emsa实验emsa:凝胶迁移或电泳迁移率检测是一种检测蛋白质和dna序列相结合的技术，初用于研究dna结合蛋白和其相关的dna结合序列相互作用，可用于定性和定量分析。通常而言，一般的组织细胞rna-seq实验会产生1000万个读数，如果一个基因的频率超过50rpkm，即每百万读数中每千个碱基中超过50个，这一基因即被认为有表达。泊松分布下，1kb长的基因有超过500个读数和4%的小变异系数，即cv值；哺乳动物细胞通产含有200,000个mrna，因此至少要用50个单细胞一起才能到达小cv值；考虑到逆转录的效率和环境干扰等因素，为得到准确的表达和细胞种类的识别，需要使用的细胞数量实际要更多。

3.引物的od数如何定量？

答：引物合成引物od数是这样测定的：用紫外分光光度计，波长260nm，石英比色杯，光程为1厘米，测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度好稀释到0.2-1.0之间。dna干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用1ml水稀释测od值。需要根据稀释倍数换算出母液的od值。目前定量蛋白质组学技术主要分为标记(label)策略和非标记的(labelfree)定量策略，其中标记策略又分为体内标记(如silac、15n标记)，以及体外标记(如itraq、tmt标记)。

4.需要什么级别的引物？

答：引物常用的纯化方式脱盐、biorp / opc纯化、page纯化、hplc纯化。根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。