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pcr反应
其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及taqdna聚合酶耐高温性,使反应中模板与引物的结合复性可以在较高的温度下进行,结合的特-大大增加,被扩增的靶基因片段也就能保持-的正确度。再通过选择特-和保守性高的靶基因区,其特-程度就更高。
pcr反应特点
灵敏度高:pcr产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克(pg=10-12量级的起始待测模板扩增到微克μg=-6水平。能从100万个细胞中检出一个靶1细胞;在-的检测中,pcr的灵敏度可达3个rfu(空斑形成单位;在-学中zui小检出率为3个-。
简便、快速:pcr反应用耐高温的taq dna聚合酶,-地将反应液加好后,即在dna扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应,一般在2~4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放1射性污染、易推广。
纯度要求低:不需要分离-或-及培养细胞,dna 粗制品及rna均可作为扩增模板。可直接用-标本如-、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等dna扩增检测。
污染的监测
一个好的实验室,要时刻注意污染的监测,考虑有无污染是什么原因造成的污染,以便采取措施,防止和消除污染。
1、阳性对照:在建立pcr反应实验室及一般的检验单位都应设有pcr阳性对照,它是pcr反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好,经各种鉴定是该产物的标本,如以重组质粒为阳性对照,其含量宜低不宜高100个拷贝以下。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本,其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一pcr试剂经自己使用稳定,检验人员心中有数时,在以后的实验中可免设阳性对照。
2、阴性对照:每次pcr实验务必做阴性对照。它包括:
1标本对照:被检的标本是血1清就用鉴定后的正常血1清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。
2试剂对照:在pcr试剂中不加模板dna或rna,进行pcr扩增,以监测试剂是否污染。
3、重复性试验。
4、选择不同区域的引物进行pcr扩增。
普通的pcr仪
把一次pcr扩增只能运行一个特定退火温度的pcr仪,叫传统的pcr仪,也叫普通pcr仪。
它是由主机,加热模块,pcr管,热盖,控制软件组成。根据dna部分片段高温解链,降温配对聚合原理,通过循环改变加热模块的温度,微量不易于分辨的的dna部分片段进行扩增成大量的dna部分片段,从而对其进行分析鉴定。根据需要可结合电泳仪,水平电泳槽,一起应用。如果要做不同的退火温度需要多次运行。主要是做简单的,对目的基因退火温度的扩增。
该仪器主要应用于医学-检验,食品检测,科研机构,-院校教学对遗传变异,基因表达等进行研究。
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