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磷酸化酶免费咨询「在线咨询」

发布者:武汉友名生物技术有限公司  时间:2021-11-18 







长基因组序列、-是包含大的基因簇的那些的克1隆对于产生medicine和生物燃料的合成生物学和基因工程工作-重要。传统的基于pcr的克1隆方法通常受限于dna模板的长度和gc含量:标准的pcr反应常规产生至多10 kb的片段,而更长的pcr产物需要反应条件的繁琐优化,并且甚至在理想条件下,通常受限于35 kb5。或者,可通过装配多个短片段,例如重叠pcr产物或化学合成的dna寡聚物,产生长的目的基因组序列,但这样的方法趋于耗时和昂贵,-是对于获得长于50 kb的序列(其通常需要3-5阶段,每个包含多个装配事件)6,7。获得长的基因组序列的另一方法是通过基因组dna的-性酶-。




dna copy的引发

所有dna的 copy都是从固定起始点开始的,而目前已知的dna聚合酶都只能延长已存在的dna链,而不能从头合成dna链,那么一个新dna的 copy是怎样开始的呢?研究发现,dna copy时,往往先由引发酶在dna模板上合成一段rna引物,再由dna聚合酶从rna引物 3端开始合成新的dna链。对于前导链来说,这一引发过程比较简单,只要有一段rna引物,dna聚合酶就能以此为起点一直合成下去。但对于滞后链来说,引发过程就十分复杂,需要多种蛋白质和酶的协同作用,还牵涉冈崎片段的形成和连接。






dna新链的延伸由dna聚合酶 iii所催化。为了copy的不断进行,解旋酶须沿着模板前进, 边移动边解开双链。由于dna的解链,在dna双链区势必产生正超螺旋,在环状dna中更为明显,当达到一定程度后就可能造成copy叉难以再继续前进,但在细胞内dna的copy不会因出现拓扑学问题而停止,因为拓扑异构酶会解决这一问题。

随着引发体合成rna引物,dna聚合酶 iii开始不断地将引物延伸,合成dna。dna聚合酶 iii是一个多亚基复合二聚体,一个单体用于前导链的合成,另一个单体用于滞后链的合成,因此它可以在同一时间分别copydna前导链和滞后链。虽然dna前导链和滞后链copy的方向不同,但如果滞后链模板环绕dna聚合酶iii,并通过dna聚合酶 iii,然后再折向未解链的双链dna的方向,则滞后链的合成可以和前导链的合成在同一方向进行。






当dna聚合酶 iii沿着滞后链模板移动时,由特异的引发酶催化合成的rna引物即可以由dna聚合酶 iii所延伸,合成dna。当合成的dna链到达-次合成的冈崎片段的位置时,滞后链模板及刚合成的冈崎片段从dna聚合酶 iii上释放出来。由于copy叉继续向前运动,便又产生了一段单链的滞后链模板,它重新环绕dna聚合酶 iii,通过dna聚合酶iii开始合成新的滞后链冈崎片段。通过这种机制,前导链的合成不会超过滞后链太多,这样引发体在dna链上和dna聚合酶 iii以同一速度移动。在copy叉附近,形成了以dna聚合酶 iii二聚体、引发体和解旋酶构成的类似核糖体大小的以物理方式结合成的复合体,称为dna copy体。copy体在dna前导链模板和滞后链模板上移动时便合成了连续的dna前导链,以及由许多冈崎片段组成的滞后链。当冈崎片段形成后,dna聚合酶i通过其 5***3外切酶活性切除冈崎片段上的rna引物,并利用后一个冈崎片段作为引物由 5***3合成dna填补缺口。zui后由dna连接酶将冈崎片段连接起来,形成完整的dna滞后链。





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