江西PCR承诺守信「英瀚斯」

分子与质粒载体构建

实验原理

外源dna与载体分子的连接就是dna重组，这样重新组合的dna叫做重组体或重组子。重组的dna分子是在dna连接酶的作用下,有mg2+、atp存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源dna分子进行连接。分离培养:将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36士1°c培养18-24h，观察菌落形态。dna连接酶有两种：t4噬菌体dna连接酶和大肠dna连接酶。两种dna连接酶都有将两个带有相同粘性末端的dna分子连在一起的功能，而且t4噬菌体dna连接酶还有—种大肠连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链dna分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高t4噬菌体dna连接酶浓度或增加dna浓度来提高平末端的连接效率。

t4噬菌体dna连接酶催化dna连接反应分为3步：，t4dna连接酶与辅助因子atp形成酶—amp复合物；然后，酶—amp复合物再结合到具有5磷酸基和3-切口的dna上，使dna腺苷化；后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。

dna重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过(牛碱性磷酸酶)cip处理克服。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性.但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中温度，即12-16℃，连接12-16h(过夜)，这样既可大限度地发挥连接酶的活性，又-到短暂配对结构的稳定。

rip

技术概述

rip是研究体内蛋白与rna互作的重要技术。分子生物学服务公司建有100平米分子实验室，配备有pcr仪、定量pcr仪、电泳仪、恒温培养箱、恒温摇床、垂直电泳仪、蛋白转印仪、蛋白发光成像仪等设备。该技术先用甲醛等试剂交联细胞内的“蛋白-rna”互作复合物，裂解细胞后，用靶蛋白特异的抗l体(或标签抗l体)做免l疫沉淀，获得“靶蛋白-rna”互作复合物，去交联分离其中的rna;针对预测的靶蛋白结合rna的序列设计引物，

做qpcr实验，验证预测的rna是否与靶蛋白有结合，或者将分离出来的rna做高通量测序，筛选到可能与靶蛋白结合的rna。

技术流程

细胞交联-***细胞裂解-***免l疫共沉淀***去交联***rna分离***建库***高通量测序(或qpcr)。

1. 引物是如何合成的？

目前引物合成基本采用固相亚-胺三酯法。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑zhi剂(如二yi--,碘yi酸等)。dna合成仪有很多种, 主要都是由abi/pe 公司生产，而bioneer自行研制的384并行高通量dna合成仪，可实现99%的高合成率。无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。

亚-胺三酯法合成dna，具有、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚-胺三酯法是将dna固定在固相载体上完成dna链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′***5′磷酸二酯键连接。

步是将预先连接在固相载体cpg上的活性基团被保护的核苷酸与-反应，脱去其5′--的保护基团dmt，获得游离的5′--。

第二步，合成dna的原料，亚-胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′--仍然被dmt保护，与溶液中游离的5′--发生缩合反应。

第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有数5′--没有参加反应(少于2%)，用酐和1-咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。

第四步，在氧化剂碘的作用下，亚-形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以-脱去它的5′--上的保护基团dmt，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察tca处理阶段的颜色判定合-率。

通过-高温处理，连接在cpg上的引物被切下来，通过opc,和page等手段纯化引物，成品引物用c18浓缩、脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，测定od260定量，根据定单要求分装。