质粒提取试剂盒常用指南「友名生物」

水中微生物dna提取试剂盒，样本制备步骤。

步骤1. 样本过滤

1.1 从试剂盒中小心取出滤膜。用水样润湿滤膜。

1.2 将滤膜放置在滤器中，并过滤-体积的水样。

步骤2. 菌体裂解

* 提前准备：预先将恒温仪设置到70℃，将恒温箱设置到37℃。

2.1将样本过滤后的滤膜翻转放置到试剂盒提供的incubationdish平皿中。

2.2 吸取2mllysis buffer裂解液，并加到滤膜上。

2.3 将滤膜浸泡在裂解液中，小心摇匀平皿并在37°c孵育30分钟。

2.4 用平皿中的裂解液冲洗滤膜，并摇晃平皿10秒钟。

2.5 将平皿中的400μl裂解液转移至incubationtube孵育管，70°c孵育10分钟。

2.6 样本短暂离心，并加入400μl binding buffer结合液，立即涡旋充分混匀，以防止dna沉淀。请勿离心样本，并立即进行下一步。

步骤3. dna提取

3.1 将步骤2.6中的混合液~800μl转移到collectiontube收集管内的spincolumn离心柱中，小心液体不要沾到离心柱的边缘。

3.2 离心柱离心***10000× g，1分钟。弃掉收集管中的液体。重新将离心柱插到原有的收集管中。

3.3 离心柱中加入500μl洗液1。离心***10000×g，1分钟。弃掉收集管中的液体。重新将离心柱插到原有的收集管中。

3.4 离心柱中加入500μl洗液2。离心***10000×g，1分钟。弃掉收集管中的液体。将离心柱插到一个新的收集管中。

3.5 zui大速度离心3分钟，以去除残留的洗液2。

3.6 弃掉收集管。

3.7 吸取60μl已70℃预热的洗脱液，直接加到离心柱的硅胶膜上。硅胶膜表面应全部覆盖洗脱液。

3.8 室温静置2分钟，然后离心8000×g，2分钟，以洗脱dna。

3.9 样本保存管中的洗脱液即包含dna，可直接用于pcr，或储存在2~8℃，可存放1周。长期储存是在≤-18℃。

转移rna

转移rnatrna在蛋白质合成过程中负责转运-酸、-mrna遗传密码。trna占细胞总rna的10%~15%，绝大多数位于细胞质中。trna由crick于1955年提出其存在，zamecnik和 hoagland于1957年鉴定。

trna一级结构具有以下特点：

是一类单链小分子rna，长73~95nt共有序列76nt，沉降系数4s。

是含稀有碱基zui多的rna，含7-15个稀有碱基占全部碱基的15%~20%，位于非配对区。

5′末端碱基往往是鸟piao呤。

3端是cca序列，其中的腺苷酸常称为a76，其3—oh是-酸结合位点。

与dna不同，rna一般为单链长分子，不形成双螺旋结构，但是很多rna也需要通过碱基配对原则形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学功能。

rna的碱基配对规则基本和dna相同，不过除了a-u、g-c配对外，g-u也可以配对。

在细胞中，根据结构功能的不同，rna主要分三类，即trna转运rna，rrna核糖体rna，mrna信使rna。mrna是合成蛋白质的模板，内容按照细胞核中的dna所转录；trna是mrna上碱基序列即遗传密码子的识别者和-酸的转运者；rrna是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。

dna提取过程中各种试剂的作用及原理

溶液ii-naoh-sds液：naoh：-在ph大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当ph>;12或ph<3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。 在溶液ii中的naoh浓度为0.2mo1/l，加抽提液时，该系统的ph就-12.6， 因而促使染色体dna与质粒dna的变性。

　　sds：

　　sds是离子型表面活性剂。它主要功能有：

　　(1)溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。

　　(2)解聚细胞中的-白。

　　(3)sds能与蛋白质结合成为r-o-so3-…r+-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。 但是sds能抑制核糖-酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中 (用rnase去除rna时)受到干扰。