荧光定量PCR细胞分离培养「在线咨询」

分子实验介绍——荧光定量pcr检测

荧光定量pcr是检测生物样品中rna含量的普遍的方法，通过荧光染料或荧光标记的特---的探针，对pcr产物进行标记---，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。目前主要使用sybr green和taqman法对rna含量进行检测。microrna通过和靶基因mrna碱基配对引导沉默复合体risc降解mrna或抑制mrna的翻译，从而在转录后水平调控蛋白表达新发现mirna也能在转录水平调控基因表达。sybr green在低样本量时成本较低，目前选用的较多。

sybr green i是一种只与dna双链结合的荧光染料。当它与dna双链结合时，发出荧光；从dna双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链dna分子的数量。sybr green荧光染料-量pcr的基本过程是：1、开始反应，当sybr green染料与dna双链结合时发出荧光。1qpcrbuffer5μldntpmix(2mm)4μl引物1(10pm)μl2引物2(10pm)2μltaq酶(2u/ul)1μldna模板(50ng-1μg/μl)1μl加ddh2o至μl50视pcr仪有无热盖,不加或添加石蜡油。2、dna变性时，sybr green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成pcr产物。4、聚合完成后，sybr green染料与双链产物结合，定量pcr系统检测到荧光的净增量加大。

实验流程：细胞或组织rna提取-rna浓度检测-rna逆转录-定量pcr检测。

结果示例：

图 a 基因扩增曲线图；b 基因扩增溶解曲线图；c mrna相对表达量变化

从图中可以扩增曲线可以看出目的rna扩增效果，溶解曲线可以看出引物识别特---情况，通过使用δδct方法计算可以得到每个组中目的mrna表达变化。

腺---包装原理介绍

腺---是一种没有包膜的直径为79-90nm的颗粒，由252个 壳粒呈二十面体排列构成。每个壳粒的直径为7-9nm。-般:在93°c预变性3-5min,进入循环扩增阶段:93°c40s***58°c30s***72°c60s,循环30-35次，后在72°c保温7min。衣壳里是线状双链dna分子，两端各有长约100bp的反向重复序列。人体腺--- 已知有33种，分别命名为ad1-ad33，研究详细得是ad2.

腺---是一种无包膜的球型结构的---，遗传物质为线型 双股dna形式。腺---的特点：1gan染范围广对人致病性低；在逆转录酶的作用下，以---rna为模板合成cdna再通过dna、转录、翻译等过程形成---颗粒。2对增殖和非增殖细胞均具有gan染性；3能有效进行增殖； 4---滴度高；5不整合到染色体中，无插入致突变性；(6)外源基因装载容量大。由于腺---的这些特点使其广泛地应用于体 外基因转导、体内接种yi苗、和基因zhi疗等各个领域。

实验方法

1.获得目的基因序列；

2.构建---表达载体质粒；

3.表达载体质粒和包装质粒重组；

4.gan染hek293，包装出---；

5.---扩增、浓缩；

6.滴度测定。

蛋白提取

大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液, 少数与脂类结合的蛋白质则溶于---、---等有ji溶剂中，因些，可 采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。

(一)水溶液提取法

稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质常用的溶剂,通常用量是原材料体积的1-5倍,提取时需要均匀的搅拌,以利于蛋白质的溶解。实验流程：细胞或组织rna提取-rna浓度检测-rna逆转录-定量pcr检测。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度-于溶 解，缩短提取时间。但另一方面. ,温度升高会使蛋白---性失活,因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温( 5度以下)操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白 水解酶抑zhi剂(如二yi------,碘yi酸等)。

rna提取及注意事项

研究基因的表达和调控时，需要从组织或细胞中分离纯化rna。rna的高低经常影响rt-pcr、cdna库构建和northern blot等分子生物学实验的成败。

主要试剂

trizol是一种新型总rna抽提试剂，内含异---胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的---酶。

1.

trizol试剂含有，具有毒性和---性，注重操作。

2.

rnase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉，注重配带手套，样品尽可能盖严。

3. 细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低后得率，因为一部分rna会残留在未裂解的细胞中。细胞裂解之后要看不见颗粒状物质结缔组织和骨除外。在清洗和裂解细胞时在低温下操作，防止在操作过程中释放的内源rnase降解了rna。

4. 酵母和一些---由于细胞壁的---结构，可以加入trizol试剂同时加入无rnase的玻璃珠并剧烈振荡，使细胞裂解充分。

2-8℃ 避光保存一年。