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小鼠成骨细胞和破骨细胞共培养模型的建立

细胞之间的相互调控作用奠定基础.方法利用24 h内新生小鼠颅骨和4~8周龄成年小鼠四肢长分别分离、培养成骨细胞和破骨细胞，采用间接接触的培养模式将接种了骨sui单核细胞的玻片或骨片置入提前24 h接种了成骨细胞的培养皿中进行共培养.共培养-定时间后进行破 骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,trap染色鉴定和骨吸收功能检测，并进一 步采用rt- pcr对破骨细胞标志酶基因基质金属蛋白酶.9(mmp-9)、trap 和组织蛋白酶k (cathepsin k )的表达进行检测结果共培养5天后---trap(+)多核细胞形成13天trap(+ )多核细胞数目达到高峰;骨吸收陷窝在共培养7天后开始出现,随着培养时间的延长,陷窝面积呈增加趋势;破骨细胞标志基因trap在共培养3天时开始表达，而mmp-9和cathepsin k则在共培养5天后表达结论共培养体系中成骨细胞对破骨细胞调控作用----的破骨细胞具有噬骨能力，该共培养模型可用于成骨细胞和破骨细胞之间的相互调控作用研究.

大鼠gu髓间充质gan细胞的分离

操作方法

(1 )取sd大鼠( 2周龄)，颈椎脱臼法处死后立即用75%---浸泡，移入超净工作台内，用大头针固定大鼠四肢于工作台面的泡沫板上。

(2)碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，无菌条件下用灭菌消毒后的镊子和剪刀分离出大鼠股骨和胫骨，剔除骨头表面肌肉, pbs溶液冲洗两遍。

(3 )从中间剪断股骨和胫骨，用2ml无菌注she器吸取dmem/f 12溶液冲出gu髓细胞多次，再用针头吹打，吸管吸入离心管内，1000r/min离心5min，弃上清，用pbs重悬细胞。

(4 )缓慢将细胞悬液加入预先装有5ml淋巴细胞分离液的15ml离心管内，保持细胞悬液在淋巴细胞分离液上层，注意不要搅动液面,保持二者分层界面。

(5 ) 2000rpm离心15-25min，离心后溶液分4层，吸取中间骨sui基质细胞层(白色浑浊状)， pbs洗三次。

(6)用含15%胎牛xue清及青链mei素的dmem/f 12以106/ml的细胞浓度接种于25cm2培养瓶中， 置37°c、5%co2恒温培养箱中培养。

( 7 ) 24小时后弃去培养液(看细胞贴壁情况)，pbs冲洗2-3次去除末贴壁细胞，加入培养液继续培养。以后每3d半量换液1次，-般10d细胞生长融合。

(8 )经0.25%胰酶---，1 : 2传代，其后一般3-5d传代1次,选取生长---的第三代细胞进行后续实验。

目的

学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法——脂质体介导的转染。了解外源基因进入的一般性方法，观测外源蛋白的表达绿色荧光蛋白，为染色准备实验材料。

实验原理

上图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。

外源基因进入细胞主要有四种方法：法、磷酸钙法和脂质体介导法和---介导法。法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；---法是利用包装了外源基因的---细胞的方法使得其进入细胞。通常利用annexinv-fitc和碘化丙啶(pi)来区分凋亡和坏---。但是由于法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；---法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。

利用脂质体转染法重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有---的作用。

关于细胞培养的常见问题

q：培养液到底要不要加双抗青&链？

a：双抗不是细胞生长必需的。我们培养细胞时不常规使用，因为连续使用会促进耐药性细胞株的产生，导致轻度污染持续存在。一旦将从培养液中去除，这种轻度污染终将发展成为-污染。具体情况，可根据自己实验室的环境，自行决定是否使用双抗。

q：细胞培养，能更换成其它种类的培养基吗？

a：我们---建议好使用细胞提供机构或细胞库的生长培养液。有些细胞可能会适应在不同培养基中生长，在做好保种的条件下，可以分出部分细胞做测试。