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外显子测序

外显子组测序exome-seq是对定向富集的基因组dna进行高通量测序，它能够以相对低的费用对人类外显子组进行拷问。2009年，外显子组捕获工具的出现，让外显子组测序这种技术迅速红起来。到目前为止，已有超过1万个外显子组被测序。

如今有多家公司推出了外显子组捕获试剂，包括罗氏nimblegen、安捷伦、illumina，还有现在的华大基因。这些方法究竟孰优孰劣，斯坦福大学医学院遗传学系的研究人员对市场上三个主流的外显子组测序平台进行了比较。该研究结果发表在《nature biotechnology》上。研究人员利用安捷伦、illumina和nimblegen的外显子组测序平台对同一个人类-样品进行分析。他们的结 果表明，nimblegen平台作为一个使用高密度重叠探针的平台，尽管覆盖了较少的基因组区域，但在灵敏检测小的变异时所需的测序量也少。在同样获得80m测序数据的情况下，nimblegen有97%的目标序列达到10x以上的测序-，而其他产品只有90%。而安捷伦和illumina的探针能够在低密度下捕获更多数量的变异。随着对lncrna在哺乳动物进化及人类-发生和发展中作用的日益关注，lncrna调控机制已成为当前遗传学研究的-问题。此外，illumina还捕获了未翻译的区域，这是nimblegen和安捷伦平台无法靶定的。研究人员还比较了同一样品的外显子组测序和全基因组测序wgs，显示外显子组测序能够检测到wgs错过的小变异。

除了文中提到了三个主流平台，外显子组捕获方面的新产品也在不断推出，研究人员的选择也将更广泛。罗氏nimblegen即将推出新一代的外显子液相捕获产品。这一新产品将可捕获64m的基因组序列，包括外显子以及mirna，它含与其他nimblegen液相捕获产品相同的2.1m高密度探针，以高xiao、均一、特异、的定向捕获。该研究结果发表在《naturebiotechnology》上。

rna pull down 检测

rna   pull down：rna沉淀检测，是检测rna结合蛋白与其靶rna之间相互作用的主要实验方法之一。使用体外转录将rna进行生物素标记，并与细胞蛋白裂解液孵育，形成rna-蛋白复合物。复合物通过磁珠结合后分离，复合物纯化洗脱后通过western blot验证检测特性的蛋白。若筛选可能结合的蛋白通过质谱实验进行检测筛选。腺相关-的滴度在1012~1013gc/ml,可以满足各类整体实验的使用要求。

二、使用说明

1、装载探针

对于-时间较短通常为2小时以内的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照及自己感兴趣的-细胞。对于细胞-

时间较长通常为6小时以上的细胞，先用活性氧阳性对照及自己感兴趣的-细胞，后装载探针。

原位装载探针：本方法仅适用于贴壁培养细胞。按照1：1000用无培养液稀释dcfh-da，使终浓度为10微摩尔/升。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的dcfh-da。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的dcfh-da的体积为1毫升。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。但是长期以来，-的蛋白质表达分析谱并没有提升我们对生物标志物的认识，其主要原因是差异蛋白的分析结果缺乏规模化的验证。用无细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的dcfh-da。

二、操作步骤：

1. 所有在纯化系统里使用的溶液当日都需要经过 0.22μm 的滤膜抽滤、脱气处理；保存 4℃ 冰箱里的缓冲液若要在室温使用需恢复至室温后抽滤脱气；

2. 样品上柱纯化前，需先滤膜过滤，少量样品可用离心13000rpm，10min；

3. 依次用水、缓冲液洗泵；设置流速和柱前警报压压力值参阅层析柱及填料说明书，取较小的一个大耐受压力。防止柱中进入气泡，影响分离效果；

4. 当柱子限压在 0.3mpa，或者在限压状态-速很低时，ph valve 中的 restirtor 可以切换成 off line，即显示 by-pass 状态；

5. 当需要通过仪器上样环上样时，将 w1 阀口处换成带透明短软管的阀门，从此处阀门位通过倒吸样品上样；

6. 进样阀「inject」为上样状态。上样结束可将进样阀切换回「load」状态。并用纯水认真清洗上样环至少 3 次；将 w1 阀口处换回原来接头阀门。

7. 纯化结束后，用纯水清洗泵和平衡柱子；再用 20% 的-清洗泵以及系统。长期不用，层析柱应保存在 20% 的-中，泵放置在 20% -中；

8. 实验结束后及时倾倒废液瓶里的废液；