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1.欲冷冻保存之细胞应在生长---且存活率高之状态,约为80~90%致密度。
冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如hybridoma应在冷冻保存---至二日测试是否有antibody
2.细胞在液氮中可长期冻存没有时间---,而不会影响细胞活力﹔在-70度可保存数月。注意冷冻保护剂之品质。
dmso应为试剂级等级,无菌且无色是直接购买无菌产品,以5~10m1小体积分装,4℃避光保存,勿作多次解冻。
3.冻存细胞数量要足够。无论再怎么小心,细胞在冷冻和复苏过程中总会死掉一批的。所以,一开始冻存细胞的数量要足够。一般要达到5× 106 /毫升,一瓶不够两瓶凑。但是,这个不能一概而论。有些细胞,比如杂交瘤细胞,只需要1-3x 106 /毫升
冻存研磨就是为了保持实验材料酶或者-的活性,所以要选择少破坏这些物质的时候称量。我觉得应该是冻存前,但是如果不知道称取多大量,那冻存后称量动作一定要快。不是精细度---的称量,冻存后称量应该关系不大。
其实冻存研磨大的有点是研磨起来很容易,因为一般的材料都玻璃化了,很容易碎,即使是肉类。但在保存时间不需要太长、材料比较多、研磨也相对容易的时候,不---液氮,普通冷冻或---温冷冻保存就可以了,比如叶子等。
1.细胞:选对数生长期细胞,收集细胞24小时前换液一次。
2.计数:按常规方法把细胞制成细胞悬液,计数,令细胞密度达5×106/ml,离心去上清,吸入离心管中。
3.冻存液:先用培养液9分+dmso 1分或甘油配成10%的dmso冻存液,按上法一滴滴加入离心管中,然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。
4.分装:分装入无菌安剖中,每安剖加1.5毫升细胞悬液。
5.封口:用塑料安剖时拧紧瓶口即可;如用火焰封闭安剖口后,仔细检查,定要封严,---时可浸入蓝色液中观察,为安全起见,把安剖缝入纱布小袋中,以防液氮浸入后,融解时因受热发生-;纱袋一端系以线绳,末端扎有小牌,注明:细胞名称,冻存日期,以便日后查找。
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