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原位杂交试剂电话 武汉思特进
发布者：武汉思特进科技发展有限公司 时间：2021-11-26
就dna探针和rna探针的比较，dna探针在杂交过程中会出现探针双链之间退火的可能，也更倾向于在溶液中形成大分子的探针聚合体，从而影响其渗透能力。而rna 探针的应用，将提高dna-rna杂交子的热稳定性。
tips：rna探针因其单链、高分子结合力、可适应高温杂交的特性，其检测特-和灵敏度均优于dna探针。常用的rna探针标记方法为构建质粒后进行转率合成。通过pcr扩增的方法，可以更方便地进行rna探针的制备；rna探针合成后，还需验证其对目标片段检测的灵敏度和特-。
惰性多聚体可用来促进250个碱基以上的探针的杂交率。对单链探针可增加3倍，而对双链探针、随机剪切或随机引物标记的探针可增加-100倍。而短探针不需用促进剂，因其复杂度低和分子量小 ，短探针本身的杂交率就高 。-葡聚糖是一种广泛用于较长双链探针杂交的促进剂。这是一种多聚胺，平均分子量为500 000。另一种常见的促进剂是-peg，peg分子量小6000～8000、粘度低、价格低廉，但它不能完成取代-葡聚糖。在某些条件下5%～10%-葡聚糖效果较好，若用5%～10%peg则可产生-的本底。因此，使用促进剂时有-优化条件。
在条件都得到满足的情况下，杂交的成败就取决于保温时间。时间短了，杂交反应不完成；时间长了也无益，会引起非特异结合增多。一般杂交反应要进行20h左右。1966年britten和kohne用cot =值来计算杂交反应时间。cot 值实际上是杂交液中单链起始浓度co和 反应时间t的乘积。实验表明cot =100时，杂交反应基本完成。cot=0，基本上没有杂交。例如在液相杂交中未标记的dna 400μg/ml按单股dna每微克 紫外吸收值为0.024计算，总的吸收值为 9.6，如果反应时间为21h，那么对于未标记的dna来说，cot =9.6/21 =100.8,，杂交完成了。对标记dn a浓度为0.1μg/ml来说cot值为0.05，这就充分排除了标记dna的自我复性。tm值25℃时杂交zui佳，所以首先要根据公式4计算杂交体tm 值。由此式可见，通过调节盐浓度、-胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性。
在选用探针时经常会受到可利用探针种类的-。如在建立dna-时，手头没有筛选特定基因的克0隆探针，这时就可用寡核苷酸探针来代替。但必须首先纯化该基因的编码蛋白，并测定6个以上的末端-酸序列，通过反推的核苷酸序列合成一套寡核苷酸探针。如果已有其它动物的同种基因克0隆，因为人类和动物间在同一基因的核苷酸顺序上存在较高的同源性，因此可利用已鉴定的动物基因作探针来筛选人类基因克0隆。对于基因核苷酸序列背景清楚而无法获得克0隆探针时，可采用pcr方法扩增某段基因序列，并克0隆人合适的质粒载体中，即可得到自己的探针。这种方法十分简便，无论基因组dna探针还是cdna探针都可以容易地获得，而且，可以建立pcr的-方法，与探针杂交方法可作对比，可谓一举两得。
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