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发布者：武汉思特进科技发展有限公司时间：2021-12-2

原位杂交是指；分子杂交的一种形式。由未经抽---离的染色体dna，在原来位置上被变性成单链后，与探针进行分子杂交。1977年由本顿(w.d.benton)和戴维斯(r.w.davis)在原分子杂交基础上发展的一种较新的分子杂交技术。方法是将菌落或噬菌斑转移到硝9酸纤维素滤膜上，使在原位发生溶菌后变性的dna，同滤膜原位结合，再与有放5射性同位素标记的特定核苷酸“探针”杂交，其结果可用放5射自显影来显示，出现银粒的地方便是待测染色体dna上与探针互补顺序所在的位置。对快速检测转化群落中的dna序列或任何一种插入的dna序列，以及动植物的基因定位工作，都具有广泛应用价值。(见“分子杂交”、“放5射自显影”、“影印培养技术”)

杂交液中的阳离子浓度通过静电排斥作用影响了杂交体之间的链稳定性，较高的盐浓度将增加杂交体的稳定性。大于0.4m的na离子浓度，对tm值、双链复性速率的影响不大，但随着na离子浓度的降低，将---影响tm值和双链复性速率。

有2机溶2剂---胺的作用是降低dna-dna和dna-rna等双链体的解链温度。通常dna需要在0.1~0.2m na+ 90~100℃的条件下变性，那么应用于原位杂交，样品必须在65~75℃的条件下进---时间变性，这将导致样品形态学的破坏。50%---胺的应用能将杂交温度降至30~45℃。

---葡聚糖具有很强的水合性，高浓度的---葡聚糖会使得-分子无法获得周边亲水环境，增加了探针浓度，加快杂交反应速率。

另一种多聚体促进剂是聚丙0烯0酸，用其钠盐，浓度为2%～4%。与---葡聚糖相比，其优点是价格低廉，粘度低mw=90 000。小分子化学试剂酚和guandine thiocyanate也能促进杂交，它们可能是通过增加水的疏水性和降低双链和单链dna间的能量差异而发挥作用。酚作为杂交促进剂，只能在低dna浓度的液相杂交中观察到，该方法曾被称为酚乳化复性技术，该法不能用于固相杂交，因酚可引起-与膜的非特异吸附作用，即使在液相杂交中的应用也是有限的。而guandine thiocyanate可通过降低双链dna的tm值而起作用。此外，该分子还可以促进rna的杂交，有裂解细胞而抑制rnase的作用。总之，---葡聚糖和---因能用于固相杂交是目前zui常用的杂交促进剂。

总的来说，随探针浓度增加，杂交率也增加。另外，在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。依我们的经验，要获得较满意的敏感性，膜杂交中32p标记探针与非放0射性标记探针的用量分别为5～10 ng/ml和25～1000ng/ml，而原位杂交中，无论应用何种标记探针，其用量均为0.5～5.0μg/ml。探针的任何内在物理特性均不影响其使用浓度，但受不同类型标记物的固相支持物的非特异结合特性的影响。

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