直接PCR试剂服务「友名生物」

反向pcr( inverse pcr, ipcr术

原理:反向pcr是克1隆已知序列旁侧序列的一种方法，主要原理是用一种在已知序列中无切点的---性内切酶---基因组dna.后酶切片段自身环化.以环化的dna作为模板，用一对与已知序列两端特---结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的dna的部分片段，大小取决于.上述---性内切酶在已知基闲侧翼dna序列内部的酶切位点分布情况。用不同的---性内切酶---，可以得到大小不同的模板dna，再通过反向pcr获得未知片段。

该方法的不足是:需要从许多酶中选择---酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的dna部分片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶dna。大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在yac或cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向pcr得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。

竞争性pcr(competitive pcr, c-pcr技术

c-pcr技术是竞争cdna模板与目的cdna同时扩增.使用同样的引物,但一经扩增后。能从这些目的cdna区别开来。通常使用突变性竞争cdna模板.其序列与目的cdna序列相同.不过模板中仅有一个新内切位点或缺少内切位点突变性的cdna模板可用适当的内切酶水解,并用分光计测定其浓度。cdna目的序列和竞争模板相对应的含量.可用澳化乙锭染色.电泳胶直接扫描进行测定或掺入放1射性同位素标记的方法测定。竞争模板开始时的浓度是已知的.则cdna目的序列的zui初浓度就能测定。这种方法能准确测定mrna中cdna靶序列.可用于几个到10个细胞中mrna的定量。

污染原因：

1、标本间交叉污染：标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染；标本-模板在提取过程中，由于吸样污染导致标本间污染；有些微生物标本尤其是---可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。

2、pcr试剂的污染：主要是由于在pcr试剂配制过程中，由于加样、容器、双蒸水及其它溶液被pcr-模板污染。

3、pcr扩增产物污染：这是pcr反应中主要常见的污染问题。因为pcr产物拷贝量大一般为1013拷贝/ml，远远高于pcr检测数个拷贝的---，所以极微量的pcr产物污染，就可形成假阳性。还有一种容易忽视，可能造成pcr产物污染的形式是气溶胶污染。在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得---重视的问题。

4、实验室中质粒的污染：在分子生物学实验室及某些用质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见。因为质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在内的质粒，由于的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力。其污染可能性也很大。