磷酸化酶-「友名生物」

dna连接酶主要用于产生新的-分子组合，及在将其连接到载体上

这三个连续的步骤在连接酶的三个不同域进行，与双链dna接触的各个域环绕dna底物形成反应域。dna连接酶主要用于产生新的-分子组合，以及在分子克1隆前将其连接到载体上。

用于分子克1隆的dna连接酶是---来源或者噬菌体编码。所有真---，无论是嗜热或嗜温，包含一个单一的连接酶基因，编码nad*-依赖型的酶(olivera&lehman1967; takahashi et al. 1984)。

在连接反应的第yi步中， 使用nad的二磷酸作为磷酸1酐键和腺营基团转移到dna连接酶赖氨酸残基的ε----基团。腺苷酸残基然后转移到dna底物的5----基末端，变得易于受到并列的3---基团的亲核攻击。

这导致磷酸二酯键的形成，消去amp,以及形成dna链的共价连接。用于分子克1隆的dna连接酶在连接非---底物时能力有所不同，如平末端双链、dna-rna杂交体或单链dna.这些以及其他的属性归纳于表5。分子克1隆中比较常用的催化体外连接的酶是t4噬菌体编码的dna连接酶。

dna copy主要的特点是半保留copy、半不连续copy。在copy过程中，原来双螺旋的两条链并没有被破坏，它们分成单独的链，每一条旧链作为模板再合成一条新链，这样在新合成的两个dna分子中，一条链是旧的而另外一条链是新的，因此这种copy方式被称为半保留copy。

dna的两条链是反向平行的，一条是 5***3方向，另一条是 3***5方向。在copy起点处，两条链解开形成copy泡(replication bubble ), dna向两侧copy形成两个copy叉(replication fork)。随着dna的不断解旋，两条链变成单链形式，可以作为模板合成新的互补链。但是，生物细胞内所有的dna聚合酶都只 能催化 5***3延伸。因此，以3 ***5的链为模板链时，dna聚合酶可以沿 5***3的方向合成互补的新链，这条链称为前导链(leading strand )。当以另一条链为模板时则不能连续合成新链，这条链称为滞后链(lagging strand )。这时，dna聚合酶从copy叉的位置开始向远离copy叉的方向合成1?2 kb的新链片段，待copy叉向前移动相应的距离后，又重复这一过程，合成另一个类似大小的新链片段，这些片段被称为冈崎片段(okazaki fragment)。zui后，由另一种dna聚合酶和dna连接酶负责把这些冈崎片段之间的rna引物除去，并把缺口补平，使冈崎片段连成完整的dna链。这种前导链的连续copy和滞后链的不连续copy在生物细胞中是普遍存在的，称为dna的半不连续copy。

所有合成cdna条链的方法都要用依赖于rna的dna聚合酶(反转录酶)来催化反应，主要有两个关键因素，一个是mrna模板，另一个是反转录酶 。商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤---纯化到的禽类成髓细胞---amv逆转录酶和从表达化的moloney鼠---反转录酶基因的大肠中分离到的鼠---mlv反转录酶。amv反转录酶包括2个具有若干种酶活性的多肽亚基，这些活性包括依赖于rna的dna合成，依赖于dna的dna合成以及对dna-rna杂交体的rna部分进行内切降解rna酶h活性。mlv反转录酶只有单个多肽亚基，兼备依赖于rna和依赖于dna的dna合成活性，但降解dna—rna杂交体中的rna的能力较弱。且其热稳定性较amv反转录酶差。mlv反转录酶能合成较长的edna如大于2～3kb。amv反转录酶和mi。v反转录酶利用rna模板合成cdna时的适ph、适盐浓度和适温度各不相同．所以合成链时相应调整条件是非常重要的。