一步法RT-PCR试剂盒- 武汉友名生物公司

pcr循环参数

预变性模板dna完全变性与pcr酶的完全激1活对pcr能否成功-，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的taq酶激1活时间为两分钟。 

变性步骤：循环中一般95℃，30秒-使各种靶dna序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间。变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不，易造成扩增失败。 

引物退火：退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对pcr的特-有较大影响。

引物延伸：引物延伸一般在72℃进行taq酶zui适温度。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般在1000bp以上，含pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。

循环数：大多数pcr含25-35循环，过多易产生非特异扩增。

zui后延伸在zui后一个循环后，反应在72℃维持10-30分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。

pcr反应特点

灵敏度高：pcr产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12量级的起始待测模板扩增到微克μg=-6水平。能从100万个细胞中检出一个靶1细胞；在-的检测中，pcr的灵敏度可达3个rfu(空斑形成单位；在-学中zui小检出率为3个-。

简便、快速：pcr反应用耐高温的taq dna聚合酶，-地将反应液加好后，即在dna扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放1射性污染、易推广。

纯度要求低：不需要分离-或-及培养细胞，dna 粗制品及rna均可作为扩增模板。可直接用-标本如-、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等dna扩增检测。

pcr有哪些应用领域？

基因表达

通常可通过pcr来检测不同细胞类型、组织和生物体在特定时间点的基因表达差异。首先，从目标样品中分离出rna并将mrna逆转录成cdna。随后，通过由pcr扩增的cdna数量，确定mrna的初始水平。这一过程也被称为逆转录pcr。

分子克1隆

pcr被广泛应用于目标dna部分片段的克1隆，该技术被称为 pcr 克1隆。在直接pcr克1隆中，dna如，gdna、cdna、质粒dna的目标区域被扩增并插入到特殊设计的兼容载体中。

除了制备插入片段，pcr也是一种在在克1隆后筛选克1隆是否携带目标插入片段的有效方法。引物经过设计，可以用于确定载体中插入片段是否存在和插入方向。