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从动物组织中提取基因组dna

使用研钵进行匀浆时：

取1～100 mg的动物组织或人组织移入冰浴预冷的研钵中，快速用力展研成匀浆。注下列组织请加液氮研磨至粉末状。

a．富含dna酶的胰脏、脾1脏、胸腺、淋巴等组织。

b．富含胶原蛋白的皮肤、肌腱等组织。

c．富含角质蛋白的组织或坚硬的组织如骨骼等。

加入650 μl的solution a和0.9 μl的rnase a1，温和研磨30秒钟。注使用上述-注的实验材料时，请在加入solution a及rnase a1后，将研钵置于65℃水浴上研磨1分钟。

收集650 μl研磨好的组织匀浆液移至collection tube中。如果匀浆体积不足650 μl，请补充solution a至650 μl，65℃保温5分钟。

使用研磨棒进行匀浆时:

取1～100 mg的动物组织或人组织移入冰浴预冷的collection tube 中，用研磨棒快速研磨成糊状。

加入350 μl的solution a和0.9 μl的rnase a1后用研磨棒快速研磨成匀浆。

加入350 μl的solution a将研磨棒上的匀浆冲入collection tube中，充分振荡混合后，65℃保温5分钟。

植物ｄｎａ的ｃｔａｂ提取法：

1 称取新鲜叶片2-3ｇ,剪碎放入研钵中,在液氮中研磨成粉末。

2 将粉末转移到的加有7ｍｌ经预热的1 5×ｃｔａｂ提取缓冲液15ｍｌ离心管中,迅速混匀后置于65℃水浴中,温育30ｍｉｎ。

3 取出离心管,冷却至室温,加入氯1仿/异戊1醇(24:1),充分混匀,室温下2300×ｇ离心20ｍｉｎ。

4 将上清转移至另一新的15ｍｌ离心管中,加入1/10体积10%的ｃｔａｂ和等体积的氯1仿/异戊1醇。充分混匀,2300×ｇ离心20ｍｉｎ。

5 转移上清至另一新的15ｍｌ离心管中,加入等体积1%的ｃｔａｂ沉淀缓冲液,轻轻摇晃至形成ｄｎａ絮状沉淀。1000×ｇ离心10ｍｉｎ,使ｄｎａ沉淀于管底。

6 加入1 5-2ｍｌ的1ｍｏｌ/ｌｎａｃｌ及5μｌｒｎａｓｅ置于56℃水浴中过夜。待ｄｎａ完全溶解后,加2-3ｍｌ4℃预冷的95%的冰---使ｄｎａ沉淀,挑出ｄｎａ,置于1 5ｍｌ离心管中,用70%---清洗30ｍｉｎ,用离心机甩5ｓ,倒出70%---,再用95%---浸泡5ｍｉｎ,倒出95%---,在超净工作台上吹干。

7 将风干的ｄｎａ直接在4℃保存备用或溶于100μｌｔｅ溶液中于-20℃保存。

为什么用无水---沉淀dna

　　用无水---沉淀dna，这是实验中较常用的沉淀dna的方法。---的优点是可以任意比和水相混溶， ---与-不会起任何化学反应，对dna很安全，因此是理想的沉淀剂。

　　dna溶液是dna以水合状态稳定存在，当加入---时，---会夺去dna周围的水分子，使dna失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水---与dna相混合，其---的zui终含量占67%左右。 因而也可改用95%---来替代无水---(因为无水---的价格远远比95%---昂贵)。

　　但是加95%的---使总体积增大，而dna在溶液中有一定程度的溶解，因而dna损失也增大， 尤其用多次---沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀dna时可用95%---代替无水乙酵， 后面的沉淀步骤要使用无水---。也可以用0.6倍体积的---1醇选择性沉淀dna。一般在室温下放置15-30分钟即可。

用---沉淀dna时为什么一定要加naac或nacl

　　在ph为8左右的溶液中，dna分子是带负电荷的，加一定浓度的naac或nacl，使na+中和dna分子上的负电荷， 减少dna分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成dna钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时， 只有部分dna形成dna钠盐而聚合，这样就造成dna沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时， 其效果也不好。在沉淀的dna中，由于过多的盐杂质存在，影响dna的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。

　　加核糖-酶降解核糖-后，为什么再要用sds与kac来处理?

　　加进去的rnase本身是一种蛋白质，为了纯化dna，又必须去除之，加sds可使它们成为sds-蛋白复合物沉淀，再加kac使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的sds-蛋白质复合物，使沉淀完全。也可用饱和酚、*抽提再沉淀，去除rnase。在溶液中，有人以kac代替naac，也可以收到较好效果。

　　在基因操作实验中，磷酸盐缓冲系统(pka=7.2)和硼酸系统(pka=9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(ph)，可作dna的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与ca2+产生ca3(po4)2沉淀，在dna反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用tris-hcl(pka=8.0)的缓冲系统，由于缓冲液是trish+/tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存dna时，大都采用tris-hcl系统，而te缓冲液中的edta更能稳定。