实时荧光定量PCR-「在线咨询」

分子实验介绍——荧光定量pcr检测

荧光定量pcr是检测生物样品中rna含量的普遍的方法，通过荧光染料或荧光标记的特-的探针，对pcr产物进行标记-，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。目前主要使用sybr green和taqman法对rna含量进行检测。sybr green在低样本量时成本较低，目前选用的较多。(2)等电-完毕后(约需24hr，若不立即进行第二相电泳，胶条可夹在两层塑料薄膜中于-70℃保存数月。

sybr green i是一种只与dna双链结合的荧光染料。当它与dna双链结合时，发出荧光；从dna双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链dna分子的数量。sybr green荧光染料-量pcr的基本过程是：1、开始反应，当sybr green染料与dna双链结合时发出荧光。2、dna变性时，sybr green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成pcr产物。除了文中提到了三个主流平台，外显子组捕获方面的新产品也在不断推出，研究人员的选择也将更广泛。4、聚合完成后，sybr green染料与双链产物结合，定量pcr系统检测到荧光的净增量加大。

实验流程：细胞或组织rna提取-rna浓度检测-rna逆转录-定量pcr检测。

结果示例：

图 a 基因扩增曲线图；b 基因扩增溶解曲线图；c mrna相对表达量变化

从图中可以扩增曲线可以看出目的rna扩增效果，溶解曲线可以看出引物识别特-情况，通过使用δδct方法计算可以得到每个组中目的mrna表达变化。

腺-包装原理介绍

腺-是一种没有包膜的直径为79-90nm的颗粒，由252个 壳粒呈二十面体排列构成。每个壳粒的直径为7-9nm。衣壳里是线状双链dna分子，两端各有长约100bp的反向重复序列。据估计,在人类基因组中,大约每千个碱基中有一个snp,无论是比较于度多态性(rflp)分析还是微标记(str),都要广泛得多。人体腺- 已知有33种，分别命名为ad1-ad33，研究详细得是ad2.

腺-是一种无包膜的球型结构的-，遗传物质为线型 双股dna形式。腺-的特点：1gan染范围广对人致病性低；2对增殖和非增殖细胞均具有gan染性；3能有效进行增殖；不同个体之间在一个同源str位点的重复次数也不同，因而同指纹识别一样，str位点分析也可对个体进行身份识别。 4-滴度高；5不整合到染色体中，无插入致突变性；(6)外源基因装载容量大。由于腺-的这些特点使其广泛地应用于体 外基因转导、体内接种yi苗、和基因zhi疗等各个领域。

实验方法

1.获得目的基因序列；

2.构建-表达载体质粒；

3.表达载体质粒和包装质粒重组；

4.gan染hek293，包装出-；

5.-扩增、浓缩；

6.滴度测定。

聚合酶链式反应(pcr)

操作步骤

1.在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。

1qpcr buffer

5 μl

dntp mix( 2mm )

4 μl

引物1(10pm)

μl 2

引物2 ( 10pm)

2μl

taq酶(2u/ul)

1 μl

dna模板( 50ng-1μg/μl )

加ddh2o至

μl 50

视pcr仪有无热盖,不加或添加石蜡油。

2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心,立即置pcr仪上执行扩增。-般:在93°c

预变性3-5min ,进入循环扩增阶段: 93°c 40s***58°c 30s***72°c 60s ,循环30-35

次，后在72°c保温7min。

3.结束反应, pcr产物放置于4°c待电泳检测或-20°c长期保存。

4. pcr的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100ul进行抽提反应混合液,以

除去石蜡油;否则,直接取5- 10μl电泳检测。

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