一步法荧光定量RT-PCR试剂盒-「友名生物」

hot start pcr的原理

hot start pcr法是提高pcr特---的重要方法之一。这种方法可以防止在pcr反应第yi步骤因引物的错配或引物二聚体的形成而导致的非特---扩增，从而可以提高目的dna部分片段的扩增效率。takara taq hot start version，takara ex taq hot start version，takara la taq hot start version，primestar hs dna polymerase，mightyamp dna polymerase是抗1体和dna聚合酶的混合制品。抗1体在高温加热前与聚合酶相结合，抑制聚合酶的活性。在pcr反应zui初的dna变性步骤，抗1体变性，聚合酶活性恢复。

污染的监测

一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。

1、阳性对照：在建立pcr反应实验室及一般的检验单位都应设有pcr阳性对照，它是pcr反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高100个拷贝以下。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一pcr试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。

2、阴性对照：每次pcr实验务必做阴性对照。它包括：

  1标本对照：被检的标本是血1清就用鉴定后的正常血1清作对照；被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。

  2试剂对照：在pcr试剂中不加模板dna或rna,进行pcr扩增，以监测试剂是否污染。

3、重复性试验。

4、选择不同区域的引物进行pcr扩增。

原位pcr( in situ pcr)技术

原位pcr综合了pcr和原位杂交( insitu hybridization, ish)的优点是一种在组织切片或细胞涂片上原位对特定的dna或rna进行扩增.再用特---的探针原位杂交检测。原位pcr标本一般需先经化学固定,以保持组织细胞的---形态结构。细胞膜和核膜有一定的通透性,pcr扩增所需的各种成分可进入细胞内或核内。在原位对特定的dna或rna进行扩增。扩增产物由于分子量较大或互相交织，不易透过细胞膜向外弥散，故保留在原位。这样就很容易应用ish将其检出,同时还可对目的dna序列的组织细胞进行形态学分析。

 pcr反应五要素

参加pcr反应的物质主要有五种即引物(pcr引物为dna部分片段,细胞内dna复1制的引物为一段rna链)、酶、dntp、模板和缓冲液(其中需要mg2+)。

[pcr步骤]标准的pcr过程分为三步:

1.dna变性(90°c-96*c): 双链dna模板在热作用下，氢键断裂，形成单链dna

2.退火(25c-65c): 系统温度降低，引物与dna模板结合，形成局部双链。

3.延伸(70°c-75*c): 在taq酶(在72c左右，活性zui佳)的作用下，以dntp为原料，从引物的5端***3端延伸，合成与模板互补的dna链。

每一循环经过变性、退火和延伸，dna含量即增加一倍。现在有些pcr因为扩增区很短，即使taq酶活性不是zui佳也能在很短的时间内copy完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60°c -65c间进行，以减少一次升降温过程，提

高了反应速度。