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GISH电话「思特进」

发布者:武汉思特进科技发展有限公司  时间:2021-12-30 









原位杂交技术可应用于什么方面

1.细胞特---mrna转录的定位 可用于基因图谱、基因表达和基因组进化的研究。

2.感6染组织中---dna/rna的检测和定位,如eb---mrna、人类乳3头状瘤---和巨细胞---dna的检测。

3.癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化的检测。

4.基因在染色体上的定位。

5.检测染色体的变化,如染色体数量异常和染色体易位等。

6.分裂间期细胞遗传学的研究,如遗传病的产前诊断和某些遗传









杂交液中的阳离子浓度通过静电排斥作用影响了杂交体之间的链稳定性,较高的盐浓度将增加杂交体的稳定性。大于0.4m的na离子浓度,对tm值、双链复性速率的影响不大,但随着na离子浓度的降低,将---影响tm值和双链复性速率。

有2机溶2剂---胺的作用是降低dna-dna和dna-rna等双链体的解链温度。通常dna需要在0.1~0.2m na+ 90~100℃的条件下变性,那么应用于原位杂交,样品必须在65~75℃的条件下进---时间变性,这将导致样品形态学的破坏。50%---胺的应用能将杂交温度降至30~45℃。

---葡聚糖具有很强的水合性,高浓度的---葡聚糖会使得-分子无法获得周边亲水环境,增加了探针浓度,加快杂交反应速率。



另一种多聚体促进剂是聚丙0烯0酸,用其钠盐,浓度为2%~4%。与---葡聚糖相比,其优点是价格低廉,粘度低mw=90 000。小分子化学试剂酚和guandine thiocyanate也能促进杂交,它们可能是通过增加水的疏水性和降低双链和单链dna间的能量差异而发挥作用。酚作为杂交促进剂,只能在低dna浓度的液相杂交中观察到,该方法曾被称为酚乳化复性技术,该法不能用于固相杂交,因酚可引起-与膜的非特异吸附作用,即使在液相杂交中的应用也是有限的。而guandine thiocyanate可通过降低双链dna的tm值而起作用。此外,该分子还可以促进rna的杂交,有裂解细胞而抑制rnase的作用。总之,---葡聚糖和---因能用于固相杂交是目前zui常用的杂交促进剂。



在条件都得到满足的情况下,杂交的成败就取决于保温时间。时间短了,杂交反应不完成;时间长了也无益,会引起非特异结合增多。一般杂交反应要进行20h左右。1966年britten和kohne用cot =值来计算杂交反应时间。cot 值实际上是杂交液中单链起始浓度co和 反应时间t的乘积。实验表明cot =100时,杂交反应基本完成。cot=0,基本上没有杂交。例如在液相杂交中未标记的dna 400μg/ml按单股dna每微克 紫外吸收值为0.024计算,总的吸收值为 9.6,如果反应时间为21h,那么对于未标记的dna来说,cot =9.6/21 =100.8,,杂交完成了。对标记dn a浓度为0.1μg/ml来说cot值为0.05,这就充分排除了标记dna的自我复性。tm值25℃时杂交zui佳,所以首先要根据公式4计算杂交体tm 值。由此式可见,通过调节盐浓度、---胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性。




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