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反向pcr( inverse pcr, ipcr术

原理:反向pcr是克1隆已知序列旁侧序列的一种方法，主要原理是用一种在已知序列中无切点的---性内切酶---基因组dna.后酶切片段自身环化.以环化的dna作为模板，用一对与已知序列两端特---结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的dna的部分片段，大小取决于.上述---性内切酶在已知基闲侧翼dna序列内部的酶切位点分布情况。用不同的---性内切酶---，可以得到大小不同的模板dna，再通过反向pcr获得未知片段。

该方法的不足是:需要从许多酶中选择---酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的dna部分片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶dna。大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在yac或cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向pcr得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。

不对称pcr(asymmetric pcr枝术

两种引物浓度比例相差较大的pcr技术称不对称pcr.在扩增循环中引入不同的引物浓度.常用50~ 100+1比例。在起初的10~ 15个循环中主要产物还是双链dna.但当低浓度引物被消耗尽后。高浓度引物介导的pcr反应就会产生大量单链dna.

应用:可制备单链dna部分片段用于序列分析或---杂交的探针。

反转录pcr(reverse transc ription, rt- pcr技术

当扩增模板为rna时。需先通过反转录酶将其反转录为cdna才能进行扩增。rt - pcr应用非常广泛。无论是分子生物学还是---检验等都经常采用。

修饰引物pcr技术

为达到某些特殊应用目的.如定向克1隆、定1点突变、体外转录及序列分析等。可在引物的5*-端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分析结合位点等。

污染原因：

1、标本间交叉污染：标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染；标本---模板在提取过程中，由于吸样污染导致标本间污染；有些微生物标本尤其是---可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。

2、pcr试剂的污染：主要是由于在pcr试剂配制过程中，由于加样、容器、双蒸水及其它溶液被pcr---模板污染。

3、pcr扩增产物污染：这是pcr反应中主要常见的污染问题。因为pcr产物拷贝量大一般为1013拷贝/ml，远远高于pcr检测数个拷贝的---，所以极微量的pcr产物污染，就可形成假阳性。还有一种容易忽视，可能造成pcr产物污染的形式是气溶胶污染。在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得---重视的问题。

4、实验室中质粒的污染：在分子生物学实验室及某些用质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见。因为质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在内的质粒，由于的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力。其污染可能性也很大。