实时荧光定量PCR细胞分离培养「在线咨询」

rna提取

1.弃去培养液，用pbs清洗两次1-2。

2.弃去pbs，用1000u1吸干净残余pbs。

3.加1ml trizol研磨b 41。

4. 1.5miep管标号与每孔相对应备用。

5.研磨好的溶液转移至对应的 ep管中国。

6.往每个ep管中加入250ul，剧烈震荡30s， 冰上静置12min[问l。

7. 所有样品4c离心，转速: 13500转1分钟，时间: 15min.

8. 再次标记一批同样编号ep管。

9.离心后吸上清液400u1移入相应编号的ep管中，再加入400ul异充

分混匀。4c冰箱35min。

10. 4c离心，转速: 13500转1分钟，时间: 10min.

11.弃去.上清液，加1m175%---，轻摇7]。

12. 4c离心，10600转/分钟，时间: 5min.

13. 弃上清液滤纸吸干。

14. 加depc水10ul溶解，-80c保存。进行逆转录前测浓度。

组织rna提取

1、剪米粒大小组织块放入ep管中标号。

2、ep管中加300ul trizol浸泡30分钟或更久。

3、用研磨棒研磨，以肉眼很难看到组织为宜。

4、加700u1 trizol静 置5分钟。

microrna芯片:

rna干扰(rna interference, rnai)现象是一种进化上保守的抵御或外来---qin犯的防御机制。将含有靶基因mrna同源互补序列的rnadouble strand rna， dsrna导入细胞后，能够特异地识别该mrna，引起mrna的降解，从而导致相应的功能缺失。于台式离心机以12000rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。rnai提供了一种经济、快捷、gao效的抑制特异基因表达的技术手段,该技术已被广泛用于研究基因功能和chuan染性---及恶xingzhong瘤基因zhi疗领域。目前常用的rna干扰手段为mirna、 shrna和sirna等。

mirna是一类可以通过rnai机制调节基因表达的内源性小rna，人工mirna与shrna的设计原理基本相同，由于mirna具有内源性，因此其更易产生有效的基因沉默。

技术流程：

dsrna或pre-mirna被导入细胞后，能够被一种特异的-内切酶dicer识别并切割成为小片段，这些片段在rna解旋酶的作用下解链。继之反义链在与体内一些酶包括内切酶、外切酶、解旋酶等结合形成rna-的沉默复合物rna-induced silencing complex，risc，risc与mrna同源区进行特---结合，若mirna与mrna的结合位点配对，则切割mrna；若mirna与mrna的结合位点不配对，则抑制mrna的翻译。在同样获得80m测序数据的情况下，nimblegen有97%的目标序列达到10x以上的测序---，而其他产品只有90%。

逆转录---构建及包装  

      逆转录---retrovirus是一类rna---。在逆转录酶的作用下，以---rna为模板合成cdna再通过dna、转录、翻译等过程形成---颗粒。逆转录---表达系统是一种新的重组蛋白表达系统，由逆转录---载体、辅助载体表达---包装需要的蛋白质和包装细胞系组成。线粒体测序线粒体是真核生物的重要细胞器，是生物体的能量工厂，参与能量代谢、信号转导、细胞凋亡等许多生命活动，对生物的生理活动起着---的作用。逆转录---载体在外源基因表达、基因沉默、、生物制药等得到广泛的应用。逆转录---载体主要优点：转染范围广，可以各种细胞类型，转入的外源基因可完全融合，对细胞率高，细胞不产生病变，可建立细胞系长期持续表达外源基因。

     逆转录---载体系统共有两部分组成：包装细胞系和缺陷---本身。在逆转录---载体中，去除了正常的蛋白编码序列而保留了和包装信号，通过分子技术将目的基因插入此载体上，而包装细胞系能提供---载体包装成---粒子所需的结构蛋白。逆转录---载体主要优点：转染范围广，可以各种细胞类型，转入的外源基因可完全融合，对细胞率高，细胞不产生病变，可建立细胞系长期持续表达外源基因。当重组---载体导入包装细胞后，缺陷---载体和包装细胞的互补作用共同完成---装配，该---颗粒可其它宿主细胞，此时目的基因进入该细胞并整合到细胞基因组中，导致插入序列在宿主细胞中表达，产生目的蛋白。宿主细胞不能像包装细胞那样为缺失结构基因的逆转录---提供结构蛋白，因而在宿主细胞内不会产生新的毒颗粒，---了该载体在生物制品领域的生物安全性问题。

二、操作步骤：

1. 所有在纯化系统里使用的溶液当日都需要经过 0.22μm 的滤膜抽滤、脱气处理；保存 4℃ 冰箱里的缓冲液若要在室温使用需恢复至室温后抽滤脱气；

2. 样品上柱纯化前，需先滤膜过滤，少量样品可用离心13000rpm，10min；

3. 依次用水、缓冲液洗泵；设置流速和柱前警报压压力值参阅层析柱及填料说明书，取较小的一个大耐受压力。防止柱中进入气泡，影响分离效果；

4. 当柱子限压在 0.3mpa，或者在限压状态---速很低时，ph valve 中的 restirtor 可以切换成 off line，即显示 by-pass 状态；

5. 当需要通过仪器上样环上样时，将 w1 阀口处换成带透明短软管的阀门，从此处阀门位通过倒吸样品上样；

6. 进样阀「inject」为上样状态。上样结束可将进样阀切换回「load」状态。并用纯水认真清洗上样环至少 3 次；将 w1 阀口处换回原来接头阀门。

7. 纯化结束后，用纯水清洗泵和平衡柱子；再用 20% 的---清洗泵以及系统。长期不用，层析柱应保存在 20% 的---中，泵放置在 20% ---中；

8. 实验结束后及时倾倒废液瓶里的废液；