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如何评价和选择支原体检测试剂盒

1. 灵敏度。

灵敏度常用支原体基因组的拷贝数或支原体菌株的cfu表示。

2. 特---和广谱性。

---的试剂盒应检测的支原体物种越多越多，并且特---强，即只针对支原体，不针对其他---等微生物，没有交叉反应。

3. 稳定性。

---比液体试剂的稳定性高。

4. 样本类型及样本处理。

一款好的试剂盒，会标出它适合的样本类型，也会说明如何处理样本。要注意有的样本含有抑制pcr反应的物质，因此需要处理。

5. 对照品。

一个好的试剂盒，会带有阳性对照和内控对照。内控对照是用于监测pcr是否正常。如果样本含有抑制pcr的物质，则内控对照的条带会发生缺失。有---支原体污染的样本由于样本中的支原体对内控对照产生了竞争性抑制，因此支原体条带越强，内控条带越弱

pcr方法已广泛用于科研，在工业中也有不断扩大应用的趋势，它包括检测一些病原体、检测支原体污染、检测---污染以及检测残留宿主dna等。

pcr在工业中的应用主要存在一个方法验证的问题，尤其是灵敏度的验证。灵敏度不够，就会发生漏检。另外，pcr所直接面对的样本是dna，而非病原菌或dna，因此还需要做dna抽提，这也是要注意的。

因此，如能采用pcr检测支原体并替代药典方法，还是能节省很多时间和精力。但pcr方法的验证需要较为完整。灵敏度验证是一个重要方面。灵敏度不够，就会发生漏检。《欧洲药典》第2.6.7章ep 2.6.7和《日本药典》第十七版第g3章jp g3，都规定，对于-扩增法如pcr检测支原体，如替代传统的培养法，都要求检测限达到10 cfu/ml。

具体验证可使用10cfu的支原体灵敏度标准品，它一般为---形式，需要用待测样本的样本基质需---里面不含支原体来复溶，再进行dna抽提以及pcr检测。如检测的电泳有条带，或者qpcr检测后的ct值小于40，即表明检测成功。

如何确认rna的

实时荧光定量pcr技术是通过测定rna的转录水平来评估基因的活力。rna样本提取的直接影响基因表达分析。影响rna品质的因素有以下三种：rna浓度、rna纯度和rna完整性。

检测rna浓度、纯度和完整性的方式主要有以下几种：

紫外分光光度计法：

测量260nm吸收值计算rna浓度，测量260nm/280nm吸收值的比值，用于评估rna纯度。需要注意的是：在检测-物质时应该在固定的ph溶液中进行。

260nm/280nm的比值范围在 1.9~2.1 之间。＜1.9，说明有蛋白质残留；＞2.1，说明rna可能发生降解。

琼脂糖凝胶电泳：

完整的rna通常有三条带，zui亮的是28s条带，其次是18s条带，zui淡的是5s条带部分试剂盒提取时会过滤掉5s条带。通过琼脂糖凝胶电泳可以检测28s和18s的比值。该方法主要用于检测rna的纯度和完整性。

如果28s和18s条带明亮、清晰、条带锐利，28s的亮度在18s条带的两倍以上，我们认为rna的zui好。

若rna条带出现弥散，原因可能：rna被-酶降解、电压或电流过大、上样量过高或过低等。