宁波PCR检测DNA水平 南京英瀚斯

emsa实验

emsa:凝胶迁移或电泳迁移率检测是一种检测蛋白质和dna序列相结合的技术，初用于研究dna结合蛋白和其相关的dna结合序列相互作用，可用于定性和定量分析。分为2种类型：同位素标记探针，非同位素标记探针。

通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32p同位素标记的dna或rna探针一同保温，在非变性的聚bing烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。dna-复合物或rna-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的dna结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。上机操作按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。在检测rna结合蛋白时，依据目的rna结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的dna或rn片duan和gua核苷酸片段特异，和其它非相关的片段非特异，来确定dna或rna结合蛋白的特---。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。

蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术。 一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质，一些含量十分丰富，一些仅含有几个拷贝。为了研究某一个蛋白质，必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。

一、主要方法

1. 蛋白质的选择吸附分离利用颗粒不同程度的颗粒吸附力来使分离的目的达到。

2. 按照配体特性的分离-亲和层析利用蛋白质分子与另一种称为配体的分子能够特异结合这一生物性质。

3. 低温沉淀法，使用如，---等与水可混溶的，降低多数蛋白质的溶解度并且将其析出，和盐析相比较，这种方法的分辨率的高，然而蛋白质比较容易变形，需要在低温下进行。

4. 按照分子大小不一样的方法，密度梯度离心在介质中对蛋白质离心时，蛋白质沉降速度取决于它的和密度，和密度越大，那么沉降越快；凝胶过滤一种柱层析；超过滤利用蛋白质分子不能从半透膜通过的性质。

5. 按照溶解度差异分离，等电点沉淀法盐溶与盐析使用一定浓度盐溶液来使蛋白质的溶解度增大或减小；因为在等电点时蛋白质分子的净电荷为 0，使分子间静电斥力减少了，所以，---沉淀比较容易，这时具有小的溶解度。

6. 按照电荷不同的分离方法。主要分为离子交换层析和电泳分离。

11.如何溶解引物？

答：干燥后的引物质地非常疏松，开盖前好离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mm tris ph7.5缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32p同位素标记的dna或rna探针一同保温，在非变性的聚bing烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的ph值比较低ph4-5,引物在这种条件下不稳定。

12.如何保存引物？

答：引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。引物在溶解前，室温状态下可以长期保存。溶解后的引物-20度可以长期保存。如果对实验的重复性要求较高，合成的od数较大，建议分装，避免反复冻融。修饰荧光引物需要避光保存。