湖南PCR运动能力检测 英瀚斯生物科技公司

动物组织细胞基因组dna提取

操作步骤

1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g0.5cm3，尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶k

500ug/ml20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另

一离心管中。

2.加2倍体积异，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul te 重新溶解。可进行pcr反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行

3.加等量的酚??振荡混匀，离心12000 rpm，5min。

4.取上层溶液至另一管，加入等体积的?，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。

5. 取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/l氨加入2倍体积的无水-，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ,10min。

6.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。

7.用1ml 70%-洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ， 5min。

8.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。

9.加200ul te重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?c20℃保存备用。

10.吸取适量样品于genequant上检测浓度和纯度。

蛋白质双向电泳实验流程

1.-yi酸-bing酮沉淀法提取蛋白

2.双向电泳分离待测样品

(1)一相等电-前处理按照所用仪器的厂商提供操作手册进行。蛋白质上样浓度不要超过10mg/ml,否则会造成蛋白质的-或沉淀。

(2)等电-完毕后(约需24hr，若不立即进行第二相电泳，胶条可夹在两层塑料薄膜中于-70℃保存数月。

(3)等电-好的胶条按厂商提供的操作手册平衡两次。平衡完毕后，于电泳仪上用12.5%sds-page凝胶进行电泳分离。仪器设置为2.5w/胶 45min，15w/胶 5-8hr，20℃。

3.银染法对凝胶进行染色

(1)固定(2)清洗(3)增敏(4)清洗(5)染色(6)清洗(7)显影(8)定影(9)水洗

3.凝胶扫描及图像分析

(1)图像扫描：凝胶染色后采用image scanner以300dpi，16-bit模式65536灰阶进行扫描。

(2)图像分析：扫描完毕后，凝胶继续置于1%yi酸中于4℃保存。扫描后的图像用imagemaster 2d platinum software软件进行分析。分析按照软件厂商提供的说明书进行。以zui小点面积30，平滑度2为主要参数zui大限度检测蛋白质点。随后设计bsp引物进行pcr，在扩增过程中尿嘧定全部转化为胸腺嘧定，zui后对pcr产物进行测序就可以判断cpg位点是否发生jia基化，称为bsp-直接测序法。以目标蛋白质3个重复具有相同趋势，目标蛋白质相邻位点的相对一致性，至少2个重复有2倍以上差异作为判定差异表达蛋白质的标准。

southern杂交

实验原理

      southern印迹杂交southern blot是1975年由英-southern创建，是研究dna图谱的基本技术。southern印迹杂交是进行基因组dna特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经-性内切酶-的dnal片段，将胶上的dna变性并在原位将单链dnal片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放l射自显影或酶反应显色，从而检测特定dna分子的含量。mirna在细胞生长和发育过程中起多种作用，包括调控发育、分化、凋亡和增殖等。

18.引物是经过page纯化的，为什么还有碱基缺失或插入？

答：理论-析型page变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备page电泳，上样量都是非常大，电泳时的条带非常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带回收目的引物时，很难说不割到差别仅几个碱基的引物。国内有一个不好的现象，page纯化的引物，-是长引物要的量都比较高，导致割的条带有时可能比较宽。数据分析：提供lncrna和mrna表达谱差异分析和功能分析，以及二者的关联分析。建议：您如果减少od数，引物遇到的问题可能就会少一些。

19. taqman 探针设计的基本原则是什么？

答：下列原则供您参考。

◆taqman 探针位置尽可能靠近扩增引物扩增产物50-150bp，但不能与引物重叠。

◆长度一般为18-40mer 。

◆g-c含量控制在40-80%左右。

◆避免连续相同碱基的出现，-是要避免gggg或更多g出现。

◆在引物的5端避免使用g。

◆选用比较多的碱基c。

◆退火温度tm控制在 68-70c   左右。

有用的荧光染料参数