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污染的监测

一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。

1、阳性对照：在建立pcr反应实验室及一般的检验单位都应设有pcr阳性对照，它是pcr反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高100个拷贝以下。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一pcr试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。

2、阴性对照：每次pcr实验务必做阴性对照。它包括：

  1标本对照：被检的标本是血1清就用鉴定后的正常血1清作对照；被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。

  2试剂对照：在pcr试剂中不加模板dna或rna,进行pcr扩增，以监测试剂是否污染。

3、重复性试验。

4、选择不同区域的引物进行pcr扩增。

不对称pcr(asymmetric pcr枝术

两种引物浓度比例相差较大的pcr技术称不对称pcr.在扩增循环中引入不同的引物浓度.常用50~ 100+1比例。在起初的10~ 15个循环中主要产物还是双链dna.但当低浓度引物被消耗尽后。高浓度引物介导的pcr反应就会产生大量单链dna.

应用:可制备单链dna部分片段用于序列分析或-杂交的探针。

反转录pcr(reverse transc ription, rt- pcr技术

当扩增模板为rna时。需先通过反转录酶将其反转录为cdna才能进行扩增。rt - pcr应用非常广泛。无论是分子生物学还是---检验等都经常采用。

修饰引物pcr技术

为达到某些特殊应用目的.如定向克1隆、定1点突变、体外转录及序列分析等。可在引物的5*-端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分析结合位点等。

复合pcr(multiplex pcr)技术

在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段.如果基因的某一区段有缺失则相应的电泳谱上这一区带就会消失。复合pcr主要用于同一病原体的分型及同时检测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。

重组pcr技术

重组pcr技术是在两个pcr扩增体系中,两对引物分别由其中之一在其5°-端和3-端引物上带.上一段互补的序列混合两种pcr扩增产物.经变性和复性。两组pcr产物互补序列发生粘连。其中一条重组杂合链能在pcr条件下发生聚合延伸反应，产生一个包含两个不同基因的杂合基因。