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细胞实验介绍——慢-建立稳转细胞系

慢-包装：公司使用3质粒慢-包装系统，慢-系统使用plko.1-egfp、pspax2、pmd2.g，过表达慢-系统使用plvx-acgfp、pspax2、pmd2.g三质粒系统，将质粒混匀后使用磷酸钙转染方法转染至hek293t细胞中，培养48h后，收集上清。3%的上层琼脂，每孔加1ml上层琼脂和100ul单细胞悬液(约1000ell/wel)，混匀，室温凝固。使用genecopo公司慢-颗粒纯化试剂盒将慢-纯化。纯化后留取部分检测-滴度，其余-冻存于-80℃冰箱中。

滴度检测：将-颗粒使用梯度稀释，分别293t细胞，72h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况。根据细胞荧光量计算-滴度。

细胞：在-前-对细胞进行计数，接种约10000个细胞于12孔板中，培养过夜后使用无培养基稀释-，加入12孔板中对细胞进行，-数量根据细胞的moi加入若无moi，需做-梯度：1,5,10,50,100 5个梯度对细胞，6h后去除含-溶液，加入完全培养基细胞培养，培养48h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光强度。而经过杂交瘤测序，可以获得相应的序列，可以以重组蛋白的方式来稳定获得。同时加入puromycin对细胞筛选，筛选约2周时间。细胞筛选好后，使用定量pcr和western blot检测目的基因的稳定表达情况。

实验流程：慢-质粒构建-hek293t细胞培养-质粒转染293t细胞--收集--纯化--滴度检测-细胞-稳转细胞筛选-稳转细胞鉴定

结果示例：

                                               图 a -滴度检测；b 目的细胞-效果图

mtt检测

mtt 是一种检测细胞存活和生长的方法。结论:用贴壁法成功建立了大鼠血管内皮细胞体外培养方法,冻存细胞存活率高,为体外研究提供了稳定的模型。其检测原理为活xi胞线粒体中的-脱氢酶能使外源性 mtt 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒formazan并沉积在细胞中，而-无此功能。二jia基-dmso能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免yi检测仪在 570nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活xi胞数量。

干细bao培养-分化

     干细bao是一类具有自我更新、高度增殖和多项分化潜能的细胞，理论上具有分裂能力，在特定条件下，可分化成特定组织。集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和调亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。通常改变抑制 es 细胞不分化状态的培养条件, es 细胞就可以分化成多种细胞类型。es 细胞具有的这种能力在体外增殖并保持未分化状态及其多向分化潜能的生物学特性,使其广泛应用于生物学研究的各个领域, 它的潜在医学应用价值已成为范围内研究的-。目前，已-的自es细胞-分化的细胞主要包括胰岛细胞、造血细胞、肝细胞、神经细胞、脂肪细胞、心肌细胞、内皮细胞、上皮细胞、成骨细胞、软gu细胞和黑素细胞等。