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蛋白质质谱鉴定服务

蛋白质protein是有机大分子，是构成细胞的基本有机物和生命活动的主要承担者。蛋白质在催化生命体内各种反应进行、---、抵御外来物质入l侵及控制遗传信息等方面都起着重要的作用。将含有靶基因mrna同源互补序列的rnadoublestrandrna，dsrna导入细胞后，能够特异地识别该mrna，引起mrna的降解，从而导致相应的功能缺失。蛋白质的一级结构是---酸序列，通过鉴定---酸序列来匹配它的蛋白质，这是定性研究，是蛋白质组学的基础，也是蛋白质组学的重要技术之一。

质谱一般由离子源、分析器mass ---yzer和离子检测器detector三部分组成。传统的质谱仅用于小分子挥发物质的分析，但随着新的离子化技术的出现，如基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi-tof)和电喷雾电离质谱(esi-ms)等，质谱技术的出现为蛋白质分析提供了一种新的途径。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1。现在蛋白质组学基本研究手段是：以生物质谱技术为，对蛋白质进行-、高通量分离、鉴定和分析。

蛋白质质谱鉴定的基本原理是用蛋白酶将蛋白质---成肽段混合物，经maildi或esi等软电离手段将其离子化，然后通过分析器将具有特定质核比的肽段离子分离开来。通过实际谱图和理论上蛋白质经过蛋白酶---后产生的一级质谱峰图和二级质谱峰图进行的比对，进行蛋白鉴定。传统的基于2d双向凝胶电泳分离的蛋白质组通常可以鉴定出约1000种蛋白，对全蛋白质组的覆盖仅在5~10%左右，不能满足高通量定量蛋白质表达谱分析的要求。

二、使用说明

1、装载探针

对于---时间较短通常为2小时以内的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照及自己感兴趣的---细胞。对于细胞---

时间较长通常为6小时以上的细胞，先用活性氧阳性对照及自己感兴趣的---细胞，后装载探针。

原位装载探针：本方法仅适用于贴壁培养细胞。按照1：1000用无培养液稀释dcfh-da，使终浓度为10微摩尔/升。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的dcfh-da。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的dcfh-da的体积为1毫升。(3)在pcr仪上进行热变性(95c2min),冰中骤冷，待_上机。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的dcfh-da。

15.测序发现引物有突变是怎么回事？

答：测序发现引物区域有突变，---是40个碱基以下的引物, 发生的概率不大，但是肯定也会发生。用户一般可以放心，引物序列一般都是通过电脑直接将您的序列copy到合成仪的，碱基输错的机会不多。---合成公司一般会有一套控制办法，预防碱基输入错误。发生这种突变的原因有很多解释，人们还没有办法解决这个问题。过程是将dna样品先经---或氢l氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，结果与标准品比较，用紫外光测定吸收峰值及其量，计算5mc/(5mc+5c)的积分面积就得到基因组整体的甲l基化水平。引物合成的固相合成原理都一样，采用的机器也基本相同，合成主要原料都是由可数的几家跨国公司提供的，所有每个合成服务商遇到的问题也基本类似，没有人可以超脱。

引物合成是一种多步骤的化学反应，合成也就是99%，副产品不可以避免。引物序列中插入突变往往是碱基重复，一般认为，偶连过程中，正在偶连的部分单体发生丢失dmt,导致单体又接了上去，故发生插入同一碱基的突变。至于缺失突变，一般认为是一般认为是带帽(capping)反应不造成的，caping反应主要是封闭数5′----没有参加反应单体。---闭的引物，在下一轮偶连时将不能继续参与合成。对于碱基置换的突变，产生的原因一般认为是碱基不能100%脱保护，即引物上可能含有残留保护基团，引物的这些区域不能---地与互补链配对，当扩增的产品被亚转化到大肠中，可能被---中修复系统补上了非配对的碱基。置换突变通常发生在g 转换成其它碱基。分子生物学检测技术是现代分子生物学与分子遗传学取得进步的结晶，是在人们对基因的结构以及基因的表达和调控等生命本---题的认识日益加深的基础上产生的。碱基g在一定条件下可以转化为烯醇异构体 脱呤，2,6 diaminopurine , dna和扩增过程中dna聚合酶将2,6 diaminopurine看作碱基a，测序就会发现碱基g-a置换。脱呤现象在富含呤的引物中发生的频率较高。脱呤的引物在引物后处理脱保护阶段如果被降解，测序就会发现碱基g或a的缺失。

引物合成过程中，造成碱基插入，缺失，置换突变的因素客观存在，有不少降低发生的频率建议和措施，但是这些措施还停留在实验室阶段，还没有能够应用到规模化生产中。