PCR实验室服务「英瀚斯」

dna测序检测

1. pcr测序反应

(1)取0.2ml的pcr管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂:

所加试剂测定模板管标准对照管

bigdye mix

1μl

待测的质粒dna

1μ 1

pgem-3zf (+)双链dna

-1μ1

待测dna的正向引物

m13(-21)引物- 1μ 1

灭菌去离子水

2μ 1

总反应体积5μ 1,不加轻矿物油或石蜡油，盖紧pcr管，用手指弹管混匀，稍离心。

(2)将pcr管置于9600或2400型pcr仪.上进行扩增。98c变性2min后进行pcr循环，

pcr循环参数为96c 10s， 50c 5s， 60°c4min， 25 个循环，扩增结束后设置4c保温。

2.---法纯化pcr产物

(1) 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml ep管中。

(2)加入25μ 1/---混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀dna。12 000r/min于

4c离心30 min,小心弃上清。

(3)加70%(v/v)的---50μ 1 洗涤沉淀2次。12 000r/min 于4c离心5min,小心弃上清和

管壁的液珠，真空干燥沉淀10~ 15min。

3.电泳前测序pcr产物的处理。

(1)加入12μ 1的tsr于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解dna沉淀，稍离心。

(2)将溶液转移至盖体分离的0.2ml pcr管中，稍离心。

(3)在pcr仪上进行热变性(95c 2min),冰中骤冷，待_上机。

4..上机操作按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立

运行的测序顺序文件。

5.仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过

序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。

6.测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。

蛋白质互作验证服务

在后基因组时代，基因的表达产物蛋白质作为生物功能直接的执行者和体现者，在生物集体的生理及病理中扮演着重要的角色。分子生物学服务公司建有100平米分子实验室，配备有pcr仪、定量pcr仪、电泳仪、恒温培养箱、恒温摇床、垂直电泳仪、蛋白转印仪、蛋白发光成像仪等设备。高通量的蛋白质组学研究技术可以在上述过程中筛选出具有潜在价值的生物标记和靶点。但是长期以来，-的蛋白质表达分析谱并没有提升我们对生物标志物的认识，其主要原因是差异蛋白的分析结果缺乏规模化的验证。

染色质免l疫共沉淀技术(chip)

基于体内分析而发展的染色质免l疫沉淀分析chr omat in immunoprecipitat ionassay kit, chip)技术可以真实、完整地反映结合在dna序列上的调控蛋白。由于chip采用甲醛固定活l细胞或者组织的方法，因此能比较真实的反映细胞内tf与promoter的结合情况，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。银染法对凝胶进行染色(1)固定(2)清洗(3)增敏(4)清洗(5)染色(6)清洗(7)显影(8)定影(9)水洗3。近年来,这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性,是深入分析癌l症、心血l管病以及中央神经系统紊乱等---主要通路的一-种非常有效的工具。

染色质免l疫沉淀分析(chip) 的基本原理是在活l细胞状态下，当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白、蛋白与---(dna或rna)之间会产生共价键。细胞内，当f与promoter相互结合时，它们必然靠的比较近或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。目前定量蛋白质组学技术主要分为标记(label)策略和非标记的(labelfree)定量策略，其中标记策略又分为体内标记(如silac、15n标记)，以及体外标记(如itraq、tmt标记)。固定的蛋白质dna复合物通过超声或酶处理将其随机切断为-定长度范围内的染色质小片段然后通过抗原抗l体的特---识别反应沉淀此复合体，特---地富集目的蛋白结合的dnal片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与dna相互作用的信息。通过qpcr或二代测序，筛选与目的蛋白互作的未知dna信息。

16.长链引物为什么出错的几率非常高？

答：引物合成时，每一步反应效率都不能达到100%，产生碱基插入、缺失、置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长，突变的频率累加起来就越高。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。研究人员总希望合成的引物万无一失，这种心情可以理解。但是---pcr扩增，不可能---扩增产物中没有突变，引物合成也不可能---100%正确。要知道，引物合成中发生错误非人为因素的频率，比任何高保---温聚合酶pcr扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。

17.如果测序发现突变，该如何处理？

答：遇到这种情况，首先和---合成厂家取得联系，生产人员会检查生产的原始记录，主要是核对合成序列是否和定单一致，他们在电脑中一般会保留所有原始数据。在确认引物合成序列没有输错的情况下，建议重新挑取测序，可能会找到正确的。根据经验，40个碱基以下的引物，测1-2个就可以了；40个以上的---是用于全片段拼接合成的，就需要多测一些了。cerna是目前转录调控领域的---内容之一，通过全转录组研究能够系统性的阐述cerna的分子作用机制。一般情况下，每个突变的位点都不一样，提示正确的总是有的，就是如何找到它。也可以要求公司将引物免费重合一次，不过重合的引物和次的引物一样，都可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。基因拼接过程中，如果发现一段区域突变点不多，就多测几个，否则就重合一下引物。