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转录组测序

转录组即某个物种或特定细胞在某一功能状态下产生的rna的总和，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。与基因组不同的是，转录组的定义中包含了时间和空间的限定。同一细胞在不同的生长时期及生长环境下，其基因表达情况是不相同的。转录组测序rna-seq是指利用第二代高通量测序技术进行cdna测序，快速地获取某一物种特定qi官或组织在某一状态下的转录本。相对于传统芯片而言，rna-seq无需预先设计探针，即可对物种的细胞类型的转录组进行检测，能够提供较的数字化信号，更高的检测通量以及更广泛的检测范围，是目前深入研究转录组复杂性的---工具。当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质与蛋白质间的相互作用也被保留下来。

2.引物纯化方式有哪些，如何选择？

◆　脱盐

寡核苷酸合成后，为了纯化寡核苷酸成为天然的dna结构，首先必须去除保护基团。通过浓---处理，合成的寡核苷酸从固相载体---离，2-乙-----磷酸二脂键的保护基团，以及碱基的保护基团基------基和异丁基被去除，从而形成了天然的dna结构。然而，---的去保护步骤完成后，寡核苷酸混合物还包含几种必须被去除的小分子有机化合物。所有非必须有机化合物被移除的过程通常叫做脱盐。脱盐纯化可以借助反向硅胶柱进行。尽管脱盐纯化可以移除所有的非必须有机杂质，但它不能有效移除合成中产生微量的提前终止的寡核苷酸杂链。随后设计bsp引物进行pcr，在扩增过程中尿嘧定全部转化为胸腺嘧定，zui后对pcr产物进行测序就可以判断cpg位点是否发生jia基化，称为bsp-直接测序法。然而，脱盐的寡核苷酸还是能够满足ｐｃｒ检测等基础生物研究。

◆　biorp / opc纯化

如果寡核苷酸以“三---”的形式合成，则n-寡核苷酸包含5-dmt基团，提前终止的寡核苷酸不包含该基团。因为dmt基有强的亲脂的特性，有5-dmt基团的寡核苷酸与反相树脂有亲和性，因此反相亲和树脂通常被用于寡核苷酸的纯化。利用反向树脂和5－dmt寡核苷酸存在强亲和力，但是提前终止的寡核苷酸不包含dmt基团，所以，我们能够成功的把想要的n-寡核苷酸从提前终止的寡核苷酸杂质中分离出来。(3)在pcr仪上进行热变性(95c2min),冰中骤冷，待_上机。

◆　hplc

如果合成的寡核苷酸应用于，定向诱变或定量的基因探测，那么对其纯度要求较高。脱盐或opc纯化的寡核苷酸可能达不到要求，则hplc纯化被广泛地用于这个目的。作为一种纯化树脂，阴离子交换树脂或反向树脂被用于寡核苷酸纯化。阴离子交换树脂的hplc通常显示95-98%纯化效率，对于达到35-mer寡核苷酸的纯化是充分的。反向树脂化的hplc与阴离子交换树脂的hplc呈现相似的纯化效率。因为hplc的纯化效率很大程度依靠寡核苷酸的长度，用hplc法不能有效纯化长的寡核苷酸大于35-mer)。以目标蛋白质3个重复具有相同趋势，目标蛋白质相邻位点的相对一致性，至少2个重复有2倍以上差异作为判定差异表达蛋白质的标准。

◆　page

对于长的寡核苷酸的纯化50-100mer，我们page纯化法，它使用交连的聚---凝胶(电泳)作为纯化基质。尽管page显示出高的纯化效率＞98%，但它在额外的步骤方面有一些缺陷，比如在page之后需要提取和脱盐，继而将导致纯化产率的下降。大部分线粒体基因由于其母系遗传特性以及进化速率较快等特点，被广泛地用于种群遗传学、进化生物学、谱系地理学和系统发育学、---诊断等学科领域。

3.引物的od数如何定量？

答：引物合成引物od数是这样测定的：用紫外分光光度计，波长260nm，石英比色杯，光程为1厘米，测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度好稀释到0.2-1.0之间。dna干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用1ml水稀释测od值。需要根据稀释倍数换算出母液的od值。凝胶扫描及图像分析(1)图像扫描：凝胶染色后采用imagescanner以300dpi，16-bit模式65536灰阶进行扫描。

4.需要什么级别的引物？

答：引物常用的纯化方式脱盐、biorp / opc纯化、page纯化、hplc纯化。根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。